细胞骨架范例【推荐4篇】

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细胞骨架【第一篇】

1 细胞机械应力响应的生物学基础

1．1　细胞结构的张力完整性：张力完整性结构(stress integrality structure，SIS)由承受压力构件和一系列连续的张力构件相互连接组成。这种结构的稳定性取决于结构内部完整性的保持，因而被称为张力完整性。生物学研究表明，细胞的结构符合张力完整性原理，而且细胞骨架(cellularframework，CF)的张力完整性影响细胞的形状及功能。细胞骨架的张力完整性是细胞形变的主要决定因素。有关研究表明扁平细胞比圆形细胞DNA合成更为旺盛，说明细胞的变形是信息传递的重要环节。在机械应力的作用下细胞骨架的所有构件为了分散张力和压力而发生整体重排，从而导致细胞发生形变，细胞形状调节发出的调节信息以力的形式传递。因此，机械应力的变化可以通过细胞及其骨架内的力平衡而对细胞的生长和生化性质产生影响，即细胞受到来自体外的直接的力学刺激时，它的形态和功能都会发生改变。由于张力完整性结构中存在预应力，若对该结构中的某一构件施加应力，所有相互连接的构件包括距离很远的构件就会整体重排，从而导致线性硬化响应，即结构硬度的增加与施加应力的增加成正比。活细胞线性硬化以响应通过细胞表面受体传递的应力，力学信号再通过细胞骨架的几何形状或分子结构依赖于力的变化而转变为生化响应。研究发现，骨架重排可引起细胞形态的改变，细胞骨架作为细胞内的张力框架，通过与细胞膜上分子的直接联系，将力学受体上的分子扭曲力在细胞内传递分布，再经过效应分子的扭曲力将力学信号最终表现在效应点上。

1．2　整合素：细胞整合素是一类重要的细胞表面受体，其配体主要为细胞外基质蛋白(extracellularmatrix，ECM)，如胶原蛋白、纤粘连蛋白、层粘连蛋白等。整合素通过识别这些胞外基质蛋白，介导细胞与细胞、细胞与ECM的粘附反应并接受传导级联信号，在多种基本的病理生理过程中发挥重要作用。其β亚单位的胞内区不仅能与肌动蛋白结合的蛋白质如vinculin、talin、paxillin及－actinin反应，而且还能与聚焦粘附激酶(focaladhesion kinase，FAK)的氨基端反应，FAK进一步与各种信号分子反应，如C－Src、Graf(与FAK有关的GTP酶调控因子)、IP－3激酶等，这些信号分子又可进一步激活各种下游蛋白的级联反应，包括促有丝分裂原激活蛋白激酶(mitogen－activitatedprotein kinase，MAPK)，蛋白激酶c(proteinkinase C，PKC)和PIP－5激酶等。

目前，越来越多的研究表明整合素具有机械应力转导的功能，并且主要集中于整合素聚焦粘附区域，起到变机械力学信号为化学信号的作用。采用裱衬了纤粘连蛋白或含RGD肽的微球对细胞进行剪切加载，发现力信号可以直接传入细胞骨架(表现为细胞硬度指数随应变增大而增高)，而若微球未裱衬或裱衬其他非整合素的配体，则力信号不能直接传入细胞骨架。利用磁扭转细胞计，将机械应力直接作用于细胞表面受体证实，β1整合素能将力信号传递至细胞骨架，诱导聚焦粘附的形成，支持应力依赖性细胞硬度反应，这说明整合素是外力传向细胞骨架的通道，细胞通过其表面的整合素受体及时响应，以张力整和的形式将响应的机械力信号有选择地转换到细胞和核内的不同结构部件上，如聚焦粘附络合物中的信号分子、细胞膜中的离子通道、核糖体、核膜孔、染色体、甚至可能是单个基因，实现力化学转化，从而调节细胞的生理机能，对维持细胞的生长和影响细胞的功能产生调控作用。

1．3　第二信使系统：细胞感受机械应力之后可生成一系列的第二信使分子，比如Ca2+，cAMP、PKC和IP3等。机械牵拉或剪应力作用可使成骨细胞和一些力敏感细胞(如血管内皮细胞)胞内Ca2+浓度迅速增高，Duncan等人的工作表明，应力诱导的成骨细胞胞内Ca2+浓度增高，至少部分通过应力敏感离子通道，且牵拉可使其电导增加并变得对机械刺激更为敏感。机械应变和剪应力亦均可诱导胞内IP3浓度增高，而IP3可以动员胞内钙库的释放，从而使胞内Ca2+十浓度增高。机械牵拉和剪应力均可使胞内cAMP浓度增高，而cAMP浓度的增高与力刺激诱导的细胞增殖和基质合成密切相关。机械刺激可在20s内增高IP3水平，并使IP3水平和PKC活性在2min内达到峰值。另外应力也可直接激活磷脂酶A－2参与力的转导过程。可见，Ca2+,cAMP．PKC和IP3等第二信使系统可在应力作用下发生变化。

1．4　应力反应元件：应力反应元件(stressresponsive element，SRE)是存在于细胞基因的启动子内并且能够被应力所诱导的启动基因转录的顺式调控元件，能够特异性地上调或下调相关基因的表达。目前已知的机械应力反应元件至少涉及4种转录因子结合位点及10余种受应力调控的相关基因。转录因子又称“第三信使”，是一类位于胞浆或胞膜上的蛋白质，被“第二信使”在转录后水平激活向核内转移，与特定的DNA序列结合，选择性地调节基因转录。目前在细胞上已发现至少有4种转录因子可被应力激活，它们分别是：①基因结合核因子(nuclear factor－gene binding，NF－xB)；②激活蛋白(activator protein－1，AP－1)；⑧早期生长反应蛋白(early growthresponse－1，Egr－1)；④刺激蛋白(stimulatoryprotein－1，SP1)。现已发现的10余种受机械应力调控的相关基因，根据它们的生物学特性，大致可以分为血管活性物质基因、生长因子基因、粘附分子基因、趋化因子基因、凝血因子基因和原癌基因等。

2　细胞机械应力响应可能机制

具有应力感受功能的细胞(内皮细胞、上皮细胞、心肌细胞、成骨细胞、软骨细胞、成纤维细胞等)感受力学微环境的变化，可将力信号转化为细胞内一系列生物化学信号，最终导致基因表达变化。细胞外基质、整合素、局部粘附蛋白和细胞骨架网络

相互联系，彼此之间构成了一个完善的张力整合系统。在机械应力传入细胞的过程中，细胞外基质及细胞膜均可能参与了信息传递，细胞上存在的整合素等机械应力感受器可直接将信息传入细胞内，再通过细胞骨架的传递将信息传入细胞核。

业已证明，在细胞中有好几种转导途径，包括细胞膜离子通道(特别是牵拉激活的阳离子选择性通道，如SA－cat)、与G蛋白偶联的磷脂酶C通路、细胞内钙离子和细胞骨架等都参与了细胞的力学信号转导(mechanical stress－initiatedsignal transduction，MSIST)。胞外基质－整合素－细胞骨架复合体是主要的力学信号转导途径，可以传递作用在细胞表面上的应力到细胞内各区。此外已有一些证据，包括使用不同的细胞，如成纤维细胞、上皮细胞、内皮细胞、中性粒细胞及成骨细胞，表明在肌动蛋白肌丝与整合素的细胞质区部分之间起介导作用的a－辅肌动蛋白是一个关键分子结构，干扰肌动蛋白应力纤维的形成可阻止信号向细胞核的传递。G蛋白为常见的信号转导关键分子，大G蛋白通过对其亚基上氨基酸残基的脂化修饰作用而锚定在细胞膜上，从而为其接受细胞膜结构信号提供了结构基础，而小G蛋白则通过细胞外基质―整合素―细胞骨架接受细胞外机械信号。Gudi等证实G蛋白的活化是早期心肌成纤维细胞应力刺激的机械信号转导物质。细胞膜离子通道主要为力敏感阳离子通道，如Ca2+K+、Na+等，其激活无需第二信使分子的参与。细胞外钙离子的内流和细胞内钙离子的释放也可能在力学信号转导中起一定作用。钙离子的升高起始于细胞内钙离子的释放，随即伴有钙离子内流。细胞内钙离子释放的机制可能与细胞骨架和磷脂酶c通路有关，应变所导致的细胞变形可以使与细胞骨架相连的一种磷脂酶c抑制子脱离原位，抑制子的解除可以允许磷脂酶c的激活。磷脂酶C又可激活蛋白激酶c通路，后者又产生三磷酸肌醇和甘油二脂，三磷酸肌醇则促使钙离子从细胞内的贮存处释放。细胞外钙离子内流的途径则是通过SA－cat通道。

一旦机械应力被感知，PKC以及MAPKS即被活化，导致c－fos、c－jun基因表达。Sadoshima等证实机械应力可以活化磷脂酶c、磷脂酶A2、磷脂酶D、IP3以及DAG，同时细胞膜上磷脂被磷脂酶C分解，能产生肌糖磷酸化以及diacylglycerol，而导致PKC活化，IP3激酶在细胞骨架参予的应力作用过程中扮演着关键的角色。机械应力还可直接活化酪氨酸激酶途径并将机械信号传递给鸟嘌呤核苷接合蛋白(ras)，也可直接活化MAPK、MAPKK以及raf－1激酶。

尽管存在着多条不同的信号转导通路，但它们之间是密切联系的，这表明在感受应力刺激的过程中需要的是整个细胞的参与，而不可能只依赖于单一的信号转导通路。不同的力学信号可能通过这些内在联系而又相互调控的信号通路以不同的方式来影响细胞的反应。

3　问题与展望

细胞骨架【第二篇】

Abstract AIM: To observe the changes of the cell cycle and cytoskeleton of rat calvarial osteoblasts after stimulated by recombinant human growth hormone　(rhgh ). METHODS: Osteoblastic cells from rats were incubated in the medium supplemented wiht rhgh at different doses (10, 200 μg/L), and then the changes of cytoskeleton and cell cycle were detected. RESULTS: Quantitative analysis showed that osteoblasts were arrested in S phase and G2/M phase, however, green fluorescent density and red fluorescent density (nuclei) were not significantly changed. The filamentous Factin distributed in bunches and was stained strongly and evenly. The outline of nucleus was clear. CONCLUSION: Rhgh exerts a direct anabolic effect on osteoblasts, but no obvious effect on cytoskeleton of rat osteoblasts.

Keywords osteoblasts; recombinant human growth hormone; cell cycle; cytoskeleton

摘要目的： 观察重组人生长激素（rhgh ）对体外成骨细胞（OB）细胞周期及细胞骨架Factin的影响。 方法：用浓度为10和200 μg/L的重组人生长激素加入大鼠OB培养体系，观察对大鼠OB的细胞周期及细胞骨架的影响。 结果： 定量分析表明，在rhgh 作用下，成骨细胞S期、G2/M期细胞百分比增加，OB的绿色荧光强度、红色荧光强度无显著变化。 Factin纤维呈束状平行排列，荧光染色强，分布均匀。 结论：重组人生长激素对OB的合成代谢有直接影响，但对细胞骨架无显著影响。

关键词 成骨细胞；重组人生长激素；细胞周期；细胞骨架

口腔颌骨、牙槽骨骨量丢失是影响牙齿留存、义齿及种植体修复效果的重要因素。 骨质疏松症(osteoporosis, OP）患者的颌骨具有不同程度的骨量丧失，OP与牙齿脱落之间也有密切的相关性［1］. 生长激素在人体生长发育中起着重要的作用，能促进蛋白质合成，影响脂肪和矿物质代谢，促进内脏、骨骼和全身生长。 基因重组人生长激素（recombinant human growth hormone, rhgh ）与人体生长激素具有同等的作用。 rhgh 影响骨代谢的作用机制一般有直接和间接两种方式。 直接方式是指rhgh通过成骨细胞（osteoblast,　OB）的相关受体发挥作用［2］；间接方式是可以通过促进胰岛素样生长因子(IGFI)的合成促进骨形成［3］. 我们观察不同浓度的rhgh 对体外培养OB细胞周期及细胞骨架的影响，以期对颌骨骨质疏松的防治提供实验依据。

1材料和方法

材料rhgh(长春金赛药业有限责任公司）；出生2 d的SD大鼠（第四军医大学实验动物研究中心）；FITC标记的鬼笔环肽（Phalloidin）（Sigma） ；碘化丙啶（PI）（Sigma）; Triton X100(华美生物工程公司)；流式细胞仪（美国）；激光共聚焦显微镜 BioRad MRC1024 （美国）.

方法

大鼠颅骨OB的体外培养取出生2 d的SD大鼠，弯剪断头，将头部浸入PBS培养液中分离颅盖骨。 将分离好的颅盖骨在含血清的DMEM的培养液中剪碎，大小约为1 mm3. 用眼科镊将组织块接种于25 mL培养瓶的底部并用探针均匀拨开，每瓶接种约20～30块。 将培养瓶底部向上加入含100 mL/L胎牛血清的DMEM培养液，盖好瓶盖后再松半圈，放入CO2孵箱中，37℃ 500 mL/L CO2孵育2 h，然后翻转使瓶底朝下，以后每3 d换液1 次，待细胞铺满培养瓶时，以 g/L胰蛋白酶消化，并传代培养，所用实验细胞均为第6代细胞。

的鉴定免疫组化检测细胞I型胶原的表达阳性，重氮盐法检测细胞具有碱性磷酸酶活性，四环素荧光染色法检测细胞具有矿化能力，提示实验原代培养细胞为OB.

实验分组① 空白对照组用基础培养基；② 实验组培养基中含有重组人生长激素，浓度为10和200 μg/L.

观察指标

细胞周期的测定将培养的细胞经胰蛋白酶消化、混匀后，以5×107/L的密度接种于6孔板中，培养24 h，再每两孔分别换用浓度为10和200 μg/L的重组人生长激素培养液和基础培养液，继续培养48 h, g/L胰蛋白酶消化收集各组细胞。 加入PI染料，4℃染色30 min，上机流式细胞术（FCM），联机专用软件进行处理。 同样步骤重复测定3次。

细胞骨架的激光共聚焦显微镜（laser confocal scaning microscope, LSCM）观察① 将含有不同浓度重组人生长激素的OB悬液接种于内含多聚赖氨酸包被的盖玻片的培养板中，置于孵箱中，使细胞贴壁并均匀铺于盖玻片上。 对照组和不同浓度的实验组各制备6块细胞爬片。 ② 取出细胞爬片，PBS轻洗1遍，950 mL/L乙醇固定30 min. 2 mL/L Triton X100室温下渗透10 min，PBS轻洗1遍。 5 mL/L牛血清蛋白（BSA）37℃孵育10 min，以封闭非特异性抗原，PBS轻洗1遍。 50 mg/L（PBS稀释）FITC鬼笔环肽室温下染色30~40 min，PBS清洗2遍。 加入5 mg/L碘化丙啶（PI），染色8~10 min，PBS轻洗2遍，缓冲甘油封片。 上述过程均需避光操作。 ③ 通过LSCM 观察OB微丝结构。 选用可见光激光光源，可输出488，514 nm波长激光，LSCM对细胞的扫描参数均为PMT1：Iris,; Gain,1105; offset,0. PMT2: Iris,; Gain,1052;offset,0. 计算机采集和保存图像。 应用Lasersharp图像处理软件，随机测量爬片上的OB荧光强度，进行定量分析。

统计学处理： 计量数据用x±s表示。 用 for Windows软件进行方差分析（analysis of variance, ANOVA），多个样本均数两两比较（multiple comparison）用SNKq检验。

2结果

细胞周期的测定细胞周期可分为间期和M期两个阶段。 细胞中多数细胞处于间期。 在间期中，包括DNA合成期（S期)，S期DNA含量将加倍。 S期荧光强度占受测细胞总荧光强度的百分数为S期分数。 FCM检测OB表明， 在10和200 μg/L重组人生长激素作用以后， OB细胞周期发生了改变， S期细胞百分比高于空白对照组，差异有统计学意义，两实验组间无统计学意义（P>）.表1OB细胞周期定量分析

细胞骨架的改变鬼笔环肽仅与Factin结合，与微丝有强亲和作用。 细胞图像中由FITCPhalloidin标记的Factin呈绿色荧光，主要见于胞质中(图1)；PI标记的核酸呈红色荧光，主要分布于胞核中(图2);两者重叠处为黄色(图3). 激光共聚焦显微镜观察在不同浓度的rhgh作用下，OB绿色荧光密度及红色荧光密度与对照组相比无统计学意义。 实验组间比较也无统计学意义（P>）（表2）.表2成骨细胞荧光强度定量分析结果

3讨论

传统的治疗骨质疏松药物如雌激素、降钙素等都是通过降低骨转换、抑制破骨细胞性骨吸收而发挥作用，可以阻止患者骨量进一步丢失，但不能恢复已经丢失的骨量和退变的骨结构［4］. 人体生长激素的分泌量随着衰老而递减，特别是妇女绝经后rhgh 的分泌量将明显下降。 rhgh具有刺激骨形成的作用，有可能成为一种新的能够防止骨丢失的药物。 国外临床实验表明对生长激素缺乏的患者，注射重组人生长激素1 a后，可以提高患者腰椎的骨矿物质密度［5］. 体外研究也显示，重组人生长激素对大鼠的OB增殖和碱性磷酸酶活性具有显著影响［6］.

本结果表明，重组人生长激素改变了OB细胞周期， 提高了细胞的S 期百分比，表明OB的DNA 合成速度增高， 细胞增殖加速。 同时，本实验采用激光共聚焦显微镜扫描成像系统结合FITCphalloidin标记的Factin, PI标记核酸的荧光探针双重标记技术对OB的细胞骨架进行形态观察，结果显示在不同浓度的重组人生长激素作用下OB的细胞骨架并未发生显著改变 . 细胞骨架系统是细胞质内的一种纤维状蛋白基质，包括微管、微丝、中等纤维和微梁网格等。 细胞骨架参与细胞运动、分裂分化、细胞内物质运输以及跨膜信息传递等多种功能［7-8］. 完整的细胞骨架是细胞内源性信使协调作用的基础，而微丝则是参与介导细胞变形及运动等重要生理活动的蛋白。 Factin是微丝的主要成分，参与细胞形态维持、细胞正常结构等多种功能，其结构重排及聚合和解聚的变化，在一定程度上反映了细胞的功能状况。 细胞骨架的改变是细胞凋亡的一个重要标志［9］. 实验观察到在不同浓度的重组人生长激素作用下OB的细胞骨架Factin纤维呈束状平行排列，荧光染色强，分布均匀；细胞体中央可见椭圆形红染的细胞核。 定量分析也证明绿色荧光强度和红色荧光强度并无显著差异，说明Factin在重组人生长激素作用下并未发生明显改变。

本结果表明， 在所用的实验条件下，重组人生长激素能促进OB的DNA 合成速度增高， 使细胞增殖加速；同时并未引起细胞骨架改变而引起细胞凋亡。 在细胞学水平上为国产rhgh治疗骨质疏松疾病、防止口腔骨量丢失，促进口腔保健提供了一定的实验参考。

参考文献

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细胞骨架【第三篇】

[关键词]衰老； 血管老化； 细胞骨架；人参三七川芎提取物

[Abstract]To observe the effect of extracts of ginseng， notoginseng， and Chuanxiong Rhizome on the cytoskeleton protein F-actin and G-actin of the replicative senescence vascular smooth muscle cells， with human aortic smooth muscle cells （HASMC） as the research object， and the replicative senescence 9th generation cells as the senescence models， the experiment was divided into youth group （5th generation cells）， model group （9th generation cells）， Chinese medicine low dose group （100 mg・L-1）， middle dose group （200 mg・L-1）， and high dose group （400 mg・L-1） and resveratrol group （10 μmol・L-1）. The intervention time was 48 h. β-Galactosidase specific staining method was used to calculate the ratio of blue dyeing cells. CCK-8 method was used to detect the cells proliferation. The flow cytometry was used to analyze the cell cycle. Immunofluorescent staining was used to observe morphological changes of F-actin and G-actin. The western blot assay was used to determine the expression of F-actin protein. Compared with the model group， the Chinese medicine groups and resveratrol group significantly reduced the number of blue dyeing cells， improved the ability of cells proliferation， reduced the number of cells in G0/G1 phase， increased the number of cells in S phase， and reduced the protein expression of F-actin and the formation of stress fibers， with obvious intervention effect and statistically significant difference. Therefore， the replicative senescence vascular smooth muscle cells can be used as the models for senescence research， with significant changes in morphology and protein expression of cytoskeleton protein F-actin and G-actin in the process of cells aging. The extracts of ginseng， notoginseng， and Chuanxiong Rhizome have obvious intervention effect on F-actin and G-actin， and it might be indirectly associated with delaying the aging of blood vessels.

[Key words]senescence； vascular aging； cytoskeleton； extracts of ginseng， notoginseng， and Chuanxiong Rhizoma

目前我国已进入老龄化社会，且形势十分严峻，预计到2050年，老龄化将达到峰值，65岁及以上人口将超过3亿，占总人口的20%以上[1]。衰老是疾病发生重要的决定性因素[2]，能够加速心血管疾病的其他危险因子。血管老化是人体衰老发生的关键因素，不仅导致动脉粥样硬化的发生，促进机体衰老的进程，而且可以诱发多种疾病[3]。血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cells，VSMCs）作为血管壁中膜的主要细胞成分，其表型转化及伴随出现的生物学行为改变是血管老化的重要病理学基础[4]。目前有研究表明，细胞骨架的动态改变是促使平滑肌细胞迁移、增殖及表型变化的重要细胞内信号[5]。肌动蛋白（actin）是细胞骨架微丝的主要成分，通常以单体（G-actin）或聚合体（F-actin）形式存在于细胞内，是研究 VSMCs中细胞骨架改变的重要检测指标，且其表达变化受细胞内相关信号因子的调控，如热休克蛋白27（heat shock protein 27，HSP27）、整合素蛋白和凝溶胶蛋白等[6]，其中HSP27调控作用最为肯定。

本课题组一直致力于益气活血中药延缓血管老化的研究，对增龄导致的生理性血管老化和高血压病导致的病理性血管老化进行了较系统的研究，同时，明确了益气活血中药延缓血管老化的一些关键作用机制，比如抗氧化应激、抗AngⅡ干预等，并明确了益气活血中药对血管老化的干预疗效。本研究以人主动脉平滑肌细胞骨架的微丝蛋白F-actin和G-actin为对象，观察益气活血中药人参三七川芎提取物对骨架蛋白F-actin和G-actin的干预作用，为进一步研究细胞骨架与血管老化的关系提供实验依据。

1材料

人主动脉平滑肌细胞HASMC（美国Sciencell公司，Cat No：6110，Lot No：7463）。

SMCM基础培养基（美国Sciencell公司）；胎牛血清（FBS，美国Sciencell公司）；生长因子（SMCGS，美国Sciencell公司）；双抗P/S Solution（美国Sciencell公司）；DPBS溶液（美国Sciencell公司）；细胞冻存液CFM（美国Sciencell公司）；胰酶/EDTA消化酶（美国Sciencell公司）；细胞衰老特异性β-半乳糖苷酶检测试剂盒（杰美基因医药上海科技有限公司）；细胞DNA含量检测试剂盒（细胞周期）（南京凯基生物科技发展有限公司）；CCK-8增殖试剂盒（上海东仁公司）；4%多聚甲醛（北京索莱宝公司）；Triton X-100穿透液（北京索莱宝公司）；罗丹明鬼笔环肽（美国Molecular Probes）；Alexa Flour 488（美国Molecular Probes）；二甲基亚砜（DMSO，北京索莱宝公司）；噻唑蓝MTT（北京索莱宝公司）；小鼠F-actin单克隆抗体（英国Abcam公司）；辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG（上海碧云天生物技术公司）；BCA蛋白浓度测定试剂盒（上海碧云天生物技术公司）；超敏ECL化学发光试剂盒（上海碧云天生物技术公司）；高效RIPA组织/细胞裂解液（北京索莱宝公司）。

人参、三七、川芎合剂冻干粉由北京因科瑞斯医药科技公司制备提供。药物均为道地药材，单味药成分检测符合药典的规定和标准，按3∶2∶4破碎成最粗粉，经乙醇回收提取，滤过，药渣弃去，醇提液回收乙醇至无醇味浓缩液，继续浓缩至稠膏，真空减压，干燥至干膏，粉碎装袋，每1 g冻干粉含生药 g。中药冻干粉用PBS配制成贮存液，以 μm滤器过滤并分装，质量浓度25 g・L-1，-20 ℃保存。白藜芦醇（中国食品药品检定研究院，批号111535-200502）用DMSO溶解并配制成贮存液，质量浓度50 g・L-1 ，4 ℃保存。

倒置相差显微镜及成像系统（德国Leica，型号4000B）；流式细胞仪（美国Beckmam，型号Cytomics FC500）；全自动酶标仪（美国Thermo，型号Multiskan MK3）；激光共聚焦显微镜（日本Olympus，型号FV1000）；发光凝胶成像系统（SYNGENE，型号GeneGnome XRQ）。

2方法

细胞培养及传代细胞培养一般隔天换液，待培养瓶细胞密度在90%以上时进行传代，弃去原培养基，用DPBS洗2次；加入1 mL DPBS与胰酶/EDTA混合液（比例为1∶4）；室温放置 min，待细胞变圆时，轻敲瓶底，后加入2 mL完全培养基停止消化，用吸管进行吹打，收集细胞，1 000 r・min-1离心5 min，弃上清加入培养基2～3 mL吹悬，按照1∶2或1∶3传代培养。

分组及药物浓度 实验分为6组，分别为青年组（5代细胞）、模型组（9代细胞）、中药低剂量组（100 mg・L-1）、中药中剂量组（200 mg・L-1）、中药高剂量组（400 mg・L-1）及白藜芦醇组（10 μmol・L-1），药物干预时间为48 h。

β-半乳糖苷酶（SA-β-gal）染色鉴定衰老的程度 β-半乳糖苷酶染色法是鉴定细胞衰老的重要指标[7]。将细胞以8×103个/孔接种于24孔板，次日细胞贴壁后，实验组给予药物干预，作用时间为48 h。实验前将GENMED染色液与GENMED稀释液以1∶20配制成工作液，混匀，置入37 ℃水浴箱预热。吸去原细胞培养基，加入500 μL/孔的GENMED清理液，并轻微摇晃24孔板；吸去清理液，加入500 μL/孔的GENMED固定液，室温孵育5 min；吸去固定液，加入500 μL/孔的GENMED酸性液，清洗细胞表面，并重复此操作一次；加入400 μL/孔预热的工作液，37 ℃孵育过夜，次日在光学显微镜下观察并计数，随机选取3个视野，计算蓝色细胞的数量占总视野细胞数量的比值。

检测细胞增殖能力将细胞以6×103个/孔接种于96孔板，每组设5个复孔，次日细胞贴壁后，实验组给予药物干预，作用时间为48 h。每孔加入10 μL CCK-8溶液，放入37 ℃培养箱中孵育2 h，上机检测，记录酶标仪所测定450 nm波长的吸光度（A）。

流式细胞仪分析细胞周期常规进行细胞培养，实验组药物干预48 h，消化后离心并用DPBS洗涤2次，去除上清，每组加入70%冰乙醇1 mL吹悬固定，4 ℃保存过夜。次日离心后去除固定液，DPBS洗涤1次，离心去上清，每组加入100 μL RNase A 37 ℃水浴30 min，再加入400 μL PI混匀染色，4 ℃冰箱避光放置30 min，后上机检测。

激光共聚焦显微镜观察细胞F-actin和G-actin结构的改变将细胞以6×103个/孔接种于黑色96孔板，贴壁后，实验组药物干预48 h。吸去原培养基，用DPBS清洗细胞2次，加入4%多聚甲醛100 μL/孔，室温下固定15 min，再用DPBS清洗细胞5 min×3遍；加入% Triton X-100 100 μL/孔，室温下穿透5 min，再用DPBS清洗5 min×3遍；最后加入罗丹明鬼笔环肽 μL（ U）/孔和Alexafluor488 DNase I 2 μL/孔共染色，避光室温放置30 min，再用DPBS清洗5 min×3遍，上机观察F-actin和G-actin的形态学改变。

blot 检测F-actin蛋白的表达细胞样品中加入100 μL含蛋白酶抑制剂、PMSF的RIPA 裂解液，超声波破碎仪破碎10 s，4 ℃16 000×g离心10 min，按BCA蛋白浓度检测试剂盒说明书对样品蛋白总浓度进行测定，加入样品1/4体积的5×Loading buffer，100 ℃加热10 min。进行电泳及转膜后，5%脱脂奶粉室温封闭1 h，完成后用TBST洗膜3次，一抗稀释比例1∶250，4 ℃水平摇床孵育过夜。二抗用5%脱脂奶粉封闭液稀释，稀释比例1∶3 000，室温孵育60 min，TBST洗涤3×10 min。将膜平铺在干净的保鲜膜上，滴加配置好的ECL反应液反应2 min，曝光及扫描。

统计学分析应用SPSS 软件进行统计分析，其中计量数据以±s表示，多组样本采用单因素方差分析，用Levene法检验方差齐性，若方差齐，采用LSD法进行两两比较；若方差不齐，则采用Tamhane法。以P

3结果

对SA-β-gal衰老染色的影响通过对各组染色结果的观察和计数，与青年组相比，模型组细胞蓝染数比例增多，具有显著性差异；与模型组相比，中药低、中、高剂量组及白藜芦醇组细胞蓝染数比例均明显降低，均有显著性差异（图1，表1）。

对细胞增殖能力的影响各组CCK-8细胞增殖能力的检测表明，与青年组相比，模型组A明显减少，具有显著性差异；与模型组相比，中药中剂量组A明显增加，具有显著性差异，中药低剂量组A增加，具有差异性，而中药高剂量组及白藜芦醇组A增加，但无统计学意义（表1）。

对细胞周期的影响通过对各组流式细胞周期的检测表明，与青年组相比，模型组G0/G1期细胞明显增多，S期细胞减少，均有显著性差异；与模型组相比，中药中、高剂量组及白藜芦醇组G0/G1期细胞明显减少，S期细胞增多，具有显著性差异，中药低剂量组则无统计学意义；G2/M期细胞数目变化均无统计学意义（表2）。

A.青年组；B.模型组；C.中药低剂量组（100 mg・L-1）；D.中药中剂量组（200 mg・L-1）；E. 中药高剂量组（400 mg・L-1）；F.白藜芦醇组（10 μmol・L-1）（图2，3同）。

对细胞F-actin和G-actin形态学的影响激光共聚焦显微镜显示，青年组细胞排列紧密，F-actin（红染）主要在细胞表面及外周分布，线条完整连续；G-actin（绿染）主要在细胞的中央区域分布，呈致密的椭圆形，染色清晰、饱满、圆润。模型组细胞体积变大，形态不规则，F-actin边缘毛糙不规整，出现锯齿样断裂，部分呈纵向平行排列，形成大量应力纤维；G-actin向细胞周边区域伸展，部分出现边缘变模糊呈絮状，细胞中央区域染色变弱。模型组与青年组相比，F-actin/G-actin荧光强度比值增大，具有显著统计学差异。各给药组F-actin边缘较模型组清晰光滑，且较少断裂；G-actin则主要集中于细胞中间，染色略欠饱满，尚清晰圆润。与模型组相比，中药低、中剂量组及白藜芦醇组F-actin/G-actin荧光强度比值降低，具有统计学意义，中药高剂量组则无统计学意义（图2，表3）。

对F-actin和HSP27蛋白表达的影响与青年组相比，模型组的F-actin蛋白表达明显增多，具有显著差异性；与模型组相比，中药中、高剂量组及白藜芦醇组F-actin蛋白表达减少，具有显著差异性；与青年组相比，模型组HSP27蛋白表达明显减少，具有显著差异性；与模型组相比，中药低、中、高剂量组及白藜芦醇组HSP27蛋白表达明显增多，具有显著差异性（图3，表3）。

4讨论

衰老是不可抗拒的自然规律，而血管衰老是人体衰老的关键始发因素[8]。 在血管老化的过程中，中膜平滑肌细胞高增殖、高移行、分泌性改变是内膜增厚、血管重构的关键因素。VSMC发生表型转化的过程中伴随着细胞骨架的重构，同时骨架重构又是VSMC由收缩型向合成型转化过程中细胞收缩能力下降、发生迁移和黏附等改变的病理生理基础[4]。肌动蛋白是构成细胞骨架微丝的基本成分，以单体G-actin或聚合体F-actin形式存在，肌动蛋白具有收缩、保持细胞的形状、运动、细胞间黏附等多种功能，同时参与细胞增殖过程[9]。有研究表明，调节机体衰老的多条通路均与F-actin的改变密切相关，如哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）通路、胰岛素/胰岛素样生长因子（IGF-1）通路和去乙酰化酶（SIRTS）通路等[10-12]。

气血是构成机体的基本物质，二者关系密切，随着衰老的进行，气虚血不行，血虚气不化，气虚血少，气血运行不畅，最终导致气虚血瘀之证，从而加速了机体衰老的进程。中药人参、三七、川芎合方属于益气活血治法的范畴，在心脑血管疾病中被广泛应用，三药合剂具有延缓血管衰老、保护血管内皮细胞及调节血管活性物质等作用[13-14]。白藜芦醇具有激活SIRT1通路、抗氧化、调节自噬及保持端粒酶活性等作用，是目前比较公认的延缓衰老的对照药物。

本研究以复制性衰老的血管平滑肌细胞为对象，以β-半乳糖苷酶染色、CCK-8细胞增殖活性和细胞周期作为判断细胞衰老程度的指标，并观察人参三七川芎提取物延缓细胞衰老的作用。实验结果表明衰老的细胞多停滞在细胞周期的G1期，S期细胞数量则减少，且体外增殖能力相对减弱，同时形态学表现出细胞扁平、胀大、颗粒增多的特征，并且在酸性环境下，细胞内β-半乳糖苷酶活性增加，表现为细胞蓝染数目增多。药物干预后，停滞在G1期的细胞数量减少，同时S期细胞数量增加，且β-半乳糖苷酶染色细胞蓝染数目减少，表明人参三七川芎提取物具有延缓血管平滑肌细胞衰老的作用。细胞骨架方面，青年组细胞微丝结构以单体G-actin为主，主要在细胞的中央区域分布，呈致密的椭圆形，染色清晰、饱满、圆润；聚合体F-actin主要在细胞表面及外周分布，线条完整连续。模型组G-actin向细胞周边区域伸展，部分出现边缘变模糊呈絮状，细胞中央区域染色变弱；F-actin边缘毛糙不规整，出现锯齿样断裂，部分呈纵向平行排列，且蛋白表达量增加，形成大量应力纤维。药物干预后，F-actin边缘较模型组清晰光滑，且较少断裂，蛋白表达量减少；G-actin则主要集中于细胞中间，染色略欠饱满，尚清晰圆润。而HSP27作为细胞骨架蛋白的主要调控因子，反向调节着F-actin的表达。

综上所述，复制性衰老的血管平滑肌细胞可以作为衰老研究的模型；细胞骨架微丝蛋白G-actin和 F-actin形态及蛋白表达在细胞衰老过程中改变明显，其可能直接参与平滑肌细胞由收缩型向合成型转化等衰老的进程；人参三七川芎提取物可以一定程度上延缓血管老化，且对于细胞G-actin和 F-actin有明显干预作用，其可能间接通过此作用延缓了血管老化的进程。

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[4]徐益荣，卢玉仙，王育林。 血管平滑肌细胞表型转化与骨架蛋白表达之间的关系[J]. 南通大学学报，2013，33（2）：86.

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细胞骨架【第四篇】

[关键词]软骨细胞；细胞骨架；细胞形态

关节软骨处在一个具有压应力、张应力、流体剪切力等机械应力作用的复杂力学环境中，而机械应力在调节关节软骨细胞生物学行为中具有十分重要的作用，能够对软骨细胞新陈代谢进行调控，是保证软骨基质正常状态的必要条件。可调控软骨细胞的新陈代谢，是维持正常软骨基质必不可少的条件。关节软骨组织缺乏血液供应、细胞代谢缓慢、自我修复能力较差，即使较小的软骨损伤也会引起严重的后果。我们的前期动物实验表明，中等强度的炮台运动能促进大鼠软骨缺损的修复重塑，但其作用机制尚不清楚。

本研究拟通过体外实验对大鼠关节软骨加载周期性压应力，观察应力下的软骨细胞形态和细胞骨架的变化，为软骨细胞内力一生物信号转化研究提供基础，为适度应力促进关节软骨缺损修复重塑的机制研究提供依据。

1.资料与方法

一般资料

主要包括大鼠来源及所用试剂的来源。本研究中所用大鼠为7d龄，且身体健康，均由南方医科大学实验动物中心提供。主要试剂：鼠抗人Tubulin B单克隆抗体（北京中杉金桥生物进口分装）；Dulbecco改良DMEM/Ham F12混合培养基（HyClone公司）；/L磷酸缓冲液PBS（博士德公司）；碘化丙啶（Salarbio公司）；链菌蛋白酶（Gibco公司）；胎牛血清（FBS，杭州四季青公司）；番红（Salarbio公司）；胰蛋白酶（Gibco公司）；双乙酸荧光素（Salarbio公司）；甲苯胺蓝（Salarbio公司）；4%多聚甲醛（Salarbio公司）；II型胶原酶（Gibco公司）；山羊抗小鼠IgG/FITC思牵ū本猩冀鹎派物进口分装）；I型胶原蛋白裱衬的6孔培养板（Flexercell公司）。

仪器设备

主要包括四点弯曲加力装置（四川大学华西口腔医学院研制）；流式细胞仪（Coulter，美国）；CO2培养箱（ShelLab，美国）；倒置荧光显微镜（Olympus，日本）；数码相机（Olympus，日本）。

实验方法

主要包括细胞培养、染色以及检测。

软骨细胞的分离培养及应力加载 体外分离大鼠四肢的关节软骨并进行传代培养，细胞培养传至第3代，随机分为对照组（A组）和周期性机械应力组（B组）。A组：在正常条件下培养软骨细胞；B组：软骨细胞置于周期性机械应力体系中（4000u strain）培养30min，连续3d。加载应力组细胞卸载后与对照组细胞同时进行以下检测。

番红及甲苯胺蓝染色 软骨细胞生长于柔性的硅胶膜上，选择PBS进行冲洗，并加入%番红以及1%甲苯胺蓝染液，在室温条件下，进行孵育2h。随后利用显微镜进行观察拍照。番红染色可以明确氨基葡聚糖合成情况；甲苯胺蓝染色可以明确蛋白多糖合成情况。

免疫荧光检测 当细胞的80%贴合于盖玻片后，在超净的工作台上放置一24孔的培养板，并取出贴有细胞的盖玻片，使用PBS液进行2次清洗，后加入2%的甲醛溶液，进行固定。固定后，使用%的Triton液清洗细胞3次，每次10min。加一抗（sigma公司），在37℃条件下，静置1h。将盖玻片置于24孔板上，使用%Triton液进行3次清洗，每次10min。后加如异硫氰酸荧光素（fluoresceinisothiocyanate，FITC）标记的二抗（sigma公司），37℃条件下，静置1h。将盖玻片置于24孔板，%Triton液进行3次清洗，每次10min。将所有盖玻片放置于24孔板中，使用%Triton液进行3次清洗，每次10min，后将清洗液弃去，加入4’，6-二脒基2-苯基吲哚（4’，6diamidino2-phenylindole，DAPI）进行染核，在室温条件下，进行5min。后在长方形的载玻片上低落封片剂，盖上盖玻片，并在室温条件下5min封片。用LCSM（LeicaSPS Germany）观察并记录图像。

RT-PCR检测cofilin基因表达 以TrizolRNA试剂盒提取细胞总RNA，依据GenBank上登陆cofilin基因序列，以B-actin作为内参照，设计引物序列。cofilin正义引物：TGTGGCTGTCTCTGATGGAG，反义引物：3TGTCTGGCAGGATC 3TGAC：B-acfin正义引物：CAC GTA CGT TGC TAT CCAGGC，反义引物：CTC CqT AAT GTC ACG CAC GAT。PCR条件95℃变性4min：95℃变性45s：53℃复性45s：72℃延伸90s：72℃温育10min：4℃保存24h。扩增结束后取最终产物10 u L，进行%琼脂糖凝胶电泳（含/mL）。15mA、90V稳压45min，采用kodak电泳凝胶观察系统EDASl20扫描，分析结果。

印迹检测cofilin蛋白表达 选择实验组与对照组中贴壁生长的软骨细胞悬浮液，并进行蛋白样品提取，以pierce公司生产的BCA蛋白定量检测试剂盒说明为标准稀释样品，进行蛋白浓度的检测，并选择5mg/mL的BSA液体将蛋白质标准品完全溶解，置于-20℃的环境下保存。选择取标准品用PBS 10mL，并将其稀释为100uL，保证液体的最终浓度为/mL。进行SDS-PAGE电泳，再完成转膜的过程中加入一抗与二抗，并进行ECL发光。通过扫描仪进行扫描，将图像输入到Image J软件中进行图像的定量分析。

统计学分析

应用软件进行统计分析。计量数据用（x±s）表示，行配对t检验，P

2.结果

软骨细胞的形态学观察

体外分离的大鼠关节软骨细胞培养24h后开始贴壁，72h后能够完全贴壁。并且大部分细胞表现为多边形，而细胞核表现为椭圆形或者圆形，能够清晰的观察到1～2个核仁。进行甲苯胺蓝染色后，形态学观察可见：大部分聚集于细胞内的呈深蓝色的蛋白多糖。而细胞核则被染色为深蓝色或者蓝紫色。进行番红染色后，形态学观察可见：大部分呈深红色的氨基葡聚糖阳性物质聚集于细胞内。加载组和对照组无显著差别，而应力组的关节软骨细胞发生形态改变，并且其取向逐渐趋于相同。见图1A～D。

微丝的形态学观察

实验组软骨细胞微丝为与细胞长轴平行的线状均匀纤维，排列整齐，呈线状拉伸，核深染。对照组软骨细胞微丝形态及分布较散乱，纤维显稀疏，与对照组比较核淡然。见图2A～B。

微管的形态学观察

实验组软骨细胞边缘平整、锐利，细胞微管呈网络状分布于各个细胞内以维持细胞形态，在核周可见明显的斑点状微管聚集区。对照组软骨细胞微管荧光强度明显较弱，边缘模糊，未见明显核周聚集区。见图2C～D。

中间纤维的形态学观察

实验组软骨细胞中间纤维围绕细胞核且从细胞核到细胞膜呈递增的贯穿分布，呈平滑的细丝状，成束成网，在细胞膜周围分布密集，形成亮带，中间纤维扩展的细胞外基质的部分呈现为亮带外周的微弱绿色荧光。对照组软骨细胞中间纤维排列紊乱，荧光强度普遍较弱，呈波浪状围绕细胞核分布，个别细胞中存在中间纤维的斑块状聚集，膜周亮带较弱或无，亮带以外微弱绿色荧光较宽。见图2E～F。

检测cofihn基因表达

RT-PCR检测显示实验组软骨细胞cofilin基因表达为（1 52±），对照组为（±），两组相比差异具有统计学意义（t=，P=）。见图3。

蛋白印迹检测cofifin蛋白表达

实验组软骨细胞中cofilin蛋白表达明显高于对照组软骨细胞cofilin蛋白的表达。见图4。

3.讨论

软骨在动物全身关节活动中发挥着重要作用，其含有特殊的软骨基质，因而能够承受一定的机械力而不会发生永久变形。同样，在软骨的生长发育过程中，其形态和功能的维持及损伤后的修复也离不开力学刺激，缺乏力学刺激会导致软骨退行性变。

软骨细胞在机械力的传导和转化方面起着举足轻重的作用。细胞形态是细胞功能的体现形式，是细增殖分化与凋亡等诸多胞内事件的参与者，同时，细胞形态与细胞所处的力学环境密不可分，是细胞内部力平衡的最直观外在表现，因此，对软骨细胞的形态研究，是研究机械应力影响软骨修复机制的基础。

本实验中在周期性机械应力刺激下，大鼠关节软骨细胞附壁生长良好，能够合成有软骨细胞生物学特点的粘多糖和氨基葡聚糖，并促进软骨细胞的规则排列，说明在软骨细胞的生长过程中，周期性的机械应力具有较为积极的刺激作用。临床研究证实，外力施加载荷的频率、时间与大小等均是影响软骨细胞新陈代谢和生长的刺激因素。本实验中的细胞特殊染色技术只能定性分析粘多糖及氨基葡聚糖的含量，而无法从蛋白表达的基因水平辨别蛋白合成过程中的微小差别。仍然需要更加深刻的定量分析研究，对基因和蛋白层面进行探讨，进一步阐述周期性机械应力对软骨细胞的刺激作用。

细胞骨架是维持细胞形态的重要部分，同时在维系软骨细胞功能方面也具有十分显著的作用。细胞骨架包括微丝、中间z与微管是胞骨架的组成部分，联合各种具有不同作用的调控蛋白共同构成细胞内部蛋白纤维网络体系。细胞骨架明显的为力学信号发生转导提供了十分理想化和有效化的途径。在细胞受到外界力学的刺激后，会导致细胞骨架发生重新排列，导致使细胞内应力随之发生相应的重新分布。细胞骨架的改变不仅会造成细胞形态的变化，同时也会导致细胞力学特征及生物学特征发生变化。

微丝是真核细胞中含量最丰富的一种蛋白复合体，是细胞骨架的主要成分之一，是由肌动蛋白分子螺旋状聚合成的纤丝，又称肌动蛋白丝，F-actin是细胞骨架微丝蛋白的主要成分，与细胞黏附、吞噬、运动、分裂等密切相关。细胞伸出的丝状伪足参与细胞间的通讯并使细胞具有趋化性，产生细胞形态的变化，而成束的微丝对丝状伪足起支持作用。压应力作用于软骨细胞后，微丝会出现不同方向的变化，增加细胞顶-底纵向的微丝张力，但横向微丝张力未发生变化。外界刺激到达阈值后，会破坏Actin微丝和Vimentin中间纤维聚集以及解聚的动态平衡，导致微丝发生生物学降解。应力信号通过细胞骨架网络结构传递至细胞内激活相应的信号转导通路，反馈调控，使其与组蛋白、DNA相互作用来调节复制和转录过程，细胞骨架发生重组，使细胞维持一定的机械强度适应机械力。

本研究中免疫荧光染色显示应力组较对照组微丝致密且分布均匀，荧光强度增强，取向趋于一致。实验组细胞微管呈网络状分布于各个细胞内以维持细胞形态，在核周可见明显的斑点状微管聚集区。而加载周期性机械应力后的软骨细胞中间纤维围绕细胞核且从细胞核到细胞膜呈递增的贯穿分布，呈平滑的细丝状，成束成网，在细胞膜周围分布密集，形成亮带。这些现象均表明周期性应力可促进软骨细胞的骨架重排，提高其力学适应性，而细胞骨架在软骨细胞的力学一生物学信号转导中发挥着重要作用。

Cofilin蛋白是广泛存在于真核细胞胞质内的一种可解聚的蛋白，研究表明其在细胞骨架动态改建过程中发挥着重要作用。本研究发现，在周期性的应力作用下，软骨细胞内的cofilin通路的相关基因以及蛋白的表达均发生明显的变化，这表明cofilin通路在软骨细胞力学一生物学信号的转导过程中具有十分重要的参与作用。同时进一步的研究应力传导中软骨细胞cofilin信号通路生物学相关的调控机制，有希望为明确关节软骨的修复重塑中机械应力的作用机制提供可靠的证据。