分子生物学实验步骤总结超全（精编5篇）
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分子生物学实验讲义1
实验 质粒DNA的碱裂解法提取与纯化
一、实验原理
细菌质粒是一类双链、闭环的DNA，大小范围从1kb至200kb以上不等。各种质粒都是存在于细胞质中、独立于细胞染色体之外的自主复制的遗传成份，通常情况下可持续稳定地处于染色体外的游离状态，但在一定条件下也会可逆地整合到寄主染色体上，随着染色体的复制而复制，并通过细胞分裂传递到后代。
质粒已成为目前最常用的基因克隆的载体分子，重要的条件是可获得大量纯化的质粒DNA分子。目前已有许多方法可用于质粒DNA的提取，本实验采用碱裂解法提取质粒DNA。碱裂解法是一种应用最为广泛的制备质粒DNA的方法，其基本原理为：当菌体在NaOH和SDS溶液中裂解时，蛋白质与DNA发生变性，当加入中和液后，质粒DNA分子能够迅速复性，呈溶解状态，离心时留在上清中；蛋白质与染色体DNA不变性而呈絮状，离心时可沉淀下来。
纯化质粒DNA的方法通常是利用了质粒DNA相对较小及共价闭环两个性质。例如，氯化铯-溴化乙锭梯度平衡离心、离子交换层析、凝胶过滤层析、聚乙二醇分级沉淀等方法，但这些方法相对昂贵或费时。对于小量制备的质粒DNA，经过苯酚、氯仿抽提，RNA酶消化和乙醇沉淀等简单步骤去除残余蛋白质和RNA，所得纯化的质粒DNA已可满足细菌转化、DNA片段的分离和酶切、常规亚克隆及探针标记等要求，故在分子生物学实验室中常用。
二、实验试剂
1、溶液Ⅰ： 50mM葡萄糖，25mM Tris-HCl(pH )，10mM EDTA(pH ）。1M Tris-HCl(pH ）， EDTA（pH ）10ml，葡萄糖，加ddH2O至500ml。在10 lbf/in2高压灭菌15min，贮存于4℃。
2、溶液Ⅱ： NaOH，1% SDS。2N NaOH 1ml，10%SDS 1ml，加ddH2O至10ml。使用前临时配置。
3、溶液Ⅲ：醋酸钾（KAc）缓冲液，pH 。5M KAc 300ml，冰醋酸 ，加ddH2O至500ml。4℃保存备用。
4、TE：10mM Tris-HCl(pH )，1mM EDTA(pH )。1M Tris-HCl（pH ）1ml， EDTA（pH ），加ddH2O至100ml。15 lbf/in2高压湿热灭菌20min，4℃保存备用。
5、苯酚/氯仿/异戊醇（25：24：1）
6、乙醇（无水乙醇、70%乙醇）7、5×TBE：Tris 碱54g，硼酸，EDTA-Na2·2H2O ，加ddH2O 至1000ml。15 lbf/in2高压湿热灭菌20min，4℃保存备用。
8、溴化乙锭（EB）：10mg/ml
9、RNase A（RNA酶A）：不含DNA酶(DNase-free)RNase A的10mg/ml，TE配制，沸水加热15min，分装后贮存于-20℃。
10、6×loading buffer（上样缓冲液）：%溴酚蓝，%二甲苯青FF，40%（W/V）蔗糖水溶液。11、1% 琼脂糖凝胶：称取1g琼脂糖于三角烧瓶中，加100ml ×TBE，微波炉加热至完全溶化，冷却至60℃左右，加EB母液（10mg/ml）至终浓度μg/ml（注意：EB为强诱变剂，操作时带手套），轻轻摇匀。缓缓倒入架有梳子的电泳胶板中，勿使有气泡，静置冷却30min以上，轻轻拔出梳子，放入电泳槽中（电泳缓冲液×TBE），即可上样。
三、实验操作
1、挑取LB固体培养基上生长的单菌落，接种于 LB（含相应抗生素）液体培养基中，37℃、250g振荡培养过夜（约12-14hr）。
2、取培养物入微量离心管中，室温离心8000g×1min，弃上清，将离心管倒置，使液体尽可能流尽。
3、将细菌沉淀重悬于100μl预冷的溶液Ⅰ中，剧烈振荡，使菌体分散混匀。
4、加200μl新鲜配制的溶液Ⅱ，颠倒数次混匀（不要剧烈振荡），并将离心管放置于冰上2-3min，使细胞膜裂解（溶液Ⅱ为裂解液，故离心管中菌液逐渐变清）。
5、加入150μl预冷的溶液Ⅲ，将管温和颠倒数次混匀，见白色絮状沉淀，可在冰上放置3-5min。溶液Ⅲ为中和溶液，此时质粒DNA复性，染色体和蛋白质不可逆变性，形成不可溶复合物，同时K+使SDS-蛋白复合物沉淀，4℃离心8000g × 10min, 小心移出上清于一新微量离心管中。
6、加入450μl的苯酚/氯仿/异戊醇，振荡混匀，4℃离心8000g × 10min。
7、小心移出上清于一新微量离心管中，加入倍体积（1ml）预冷的无水乙醇，混匀，室温放置5min，4℃离心12000g×10min，弃上清。
8、加入1ml预冷的70%乙醇洗涤沉淀1次，4℃离心8000g×7min，弃上清，将沉淀在室温下晾干或吹干（不能过于干燥，造成溶解困难）。
9、沉淀溶于20μl TE（含RNase A 20μg/ml），-20℃保存备用。
四、质粒DNA的电泳检测
观察琼脂凝胶中DNA的最简单方法是利用荧光染料溴化乙锭进行染色。该物质含有一个可以嵌入DNA的堆积碱基之间的一个平面基团，这个基团的固定位置及其与碱基的密切接近，导致染料与DNA结合并呈现荧光，其荧光产率比游离染料溶液有所增加。DNA吸收254nm处的紫外辐射并传递给染料，而被结合的染料本身则在302nm和366nm有光吸收。这两种情况下，被吸收的能量可在可见光谱红橙区的590nm处重新发射出来。因此，当凝胶中含有游离溴化乙锭时即可以检测到少量的DNA。
取制备的质粒DNA 1-2μl，加适当loading buffer混匀上样，采用 1-5V/cm的电压，使DNA分子从负极向正极移动至合适位置，取出凝胶置紫外灯下检测，摄片。
五、注意事项
本裂解法小量制备质粒 DNA重复性好，一般无麻烦。若所提取质粒 DNA不能被限制性内切酶切割，可通过酚/氯仿再次抽提，以清除杂质来解决问题。
六、习题：
1、什么是质粒？质粒有什么主要用途？
2、分子生物学实验中用的质粒是由野生型改建而来的，它必须具备哪三个基本要素？
3、制备的质粒DNA在琼脂糖凝胶上通常以三种形式条带存在，它们分别是什么？
实验 琼脂糖凝胶电泳实验
一、实验目的
（1）学习琼脂糖凝胶电泳的基本原理；
（2）掌握使用水平式电泳仪的方法；
二、实验原理
琼脂糖凝胶电泳是基因工程实验室中分离鉴定核酸的常规方法。核酸是两性电解质，其等电点为，在常规的电泳缓冲液中（pH约），核酸分子带负电荷，在电场中向正极移动。核酸分子在琼脂糖凝胶中泳动时，具有电荷效应和分子筛效应，但主要为分子筛效应。因此，核酸分子的迁移率由下列几种因素决定：
（1）DNA的分子大小。线状双链DNA分子在一定浓度琼脂糖凝胶中的迁移速率与DNA分子量对数成反比，分子越大则所受阻力越大，也越难于在凝胶孔隙中移动，因而迁移得越慢。
（2）DNA分子的构象。当DNA分子处于不同构象时，它在电场中移动距离不仅和分子量有关，还和它本身构象有关。相同分子量的线状、开环和超螺旋质粒DNA在琼脂糖凝胶中移动的速度是不一样的，超螺旋DNA移动得最快，而开环状DNA移动最慢。如在电泳鉴定质粒纯度时发现凝胶上有数条DNA带难以确定是质粒DNA不同构象引起还是因为含有其他DNA引起时，可从琼脂糖凝胶上将DNA带逐个回收，用同一种限制性内切酶分别水解，然后电泳，如在凝胶上出现相同的DNA图谱，则为同一种DNA。
（3）电源电压。在低电压时，线状DNA片段的迁移速率与所加电压成正比。但是随着电场强度的增加，不同分子量的DNA片段的迁移率将以不同的幅度增长，片段越大，因场强升高引起的迁移率升高幅度也越大，因此电压增加，琼脂糖凝胶的有效分离范围将缩小。要使大于2kb 的DNA 片段的分辨率达到最大，所加电压不得超过5v/cm。
（4）离子强度影响。电泳缓冲液的组成及其离子强度影响DNA的电泳迁移率。在没有离子存在时（如误用蒸馏水配制凝胶），电导率最小，DNA几乎不移动；在高离子强度的缓冲液中（如误加10×电泳缓冲液），则电导很高并明显产热，严重时会引起凝胶熔化或DNA变性。
溴化乙啶(Ethidium bromide, EB)（1）能插入DNA分子中形成复合物，在波长为254nm紫外光照射下EB能发射荧光，而且荧光的强度正比于核酸的含量，如将已知浓度的标准样品作电泳对照，就可估算出待测样品的浓度。由于溴化乙啶有致癌的嫌疑，所以现在也开发出了安全的染料，如Sybergreen。
常规的水平式琼脂糖凝胶电泳适合于DNA和RNA的分离鉴定；但经甲醛进行变性处理的琼脂糖电泳更适用于RNA的分离鉴定和Northern 杂交，因为变性后的RNA是单链，其泳动速度与相同大小的DNA分子量一样，因而可以进行RNA分子大小的测定，而且染色后条带更为锐利，也更牢固结合于硝酸纤维素膜上，与放射性或非放射性标记的探针发生高效杂交。
三、试剂与器材
（一）材料
电泳仪、水平电泳槽、样品梳子、琼脂糖等
（二）试剂 1、50*TAE(1000mL)：242g Tris, 冰醋酸， EDTA。
2、EB溶液：100mL水中加入1g溴化乙啶，磁力搅拌数小时以确保其完全溶解，分装，室温避光保存。
3、DNA加样缓冲液：%溴酚蓝，%二甲苯青，50%甘油（w/v）。
4、DNA分子量标准
四、操作方法
常规的水平式琼脂糖电泳：
制备琼脂糖凝胶：按照被分离DNA分子的大小，决定凝胶中琼脂糖的百分含量；一般情况下，可参考下表：
琼脂糖的含量（%）分离线状DNA分子的有效范围（Kb）
60-5
20-1
1、制备琼脂糖凝胶：称取琼脂糖，加入1x电泳缓冲液，待水合数分钟后，置微波炉中将琼脂糖融化均匀。在加热过程中要不时摇动，使附于瓶壁上的琼脂糖颗粒进入溶液；加热时应盖上封口膜，以减少水份蒸发。
2、胶板的制备：将胶槽置于制胶板上，插上样品梳子，注意观察梳子齿下缘应与胶槽底面保持1mm左右的间隙，待胶溶液冷却至50℃左右时，加入最终浓度为微克/毫升的EB（也可不把EB加入凝胶中，而是电泳后再用μg/ml的EB溶液浸泡染色15分钟），摇匀，轻轻倒入电泳制胶板上，除掉气泡；待凝胶冷却凝固后，垂直轻拔梳子；将凝胶放入电泳槽内，加入1x电泳缓冲液，使电泳缓冲液液面刚高出琼脂糖凝胶面；
3、加样：点样板或薄膜上混合DNA样品和上样缓冲液，上样缓冲液的最终稀释倍数应不小于1X。用10 μL微量移液器分别将样品加入胶板的样品小槽内，每加完一个样品，应更换一个加样头，以防污染，加样时勿碰坏样品孔周围的凝胶面。（注意：加样前要先记下加样的顺序和点样量）。
4、电泳：加样后的凝胶板立即通电进行电泳，DNA的迁移速度与电压成正比，最高电压不超过5V/cm。当琼脂糖浓度低于%，电泳温度不能太高。样品由负极（黑色）向正极（红色）方向移动。电压升高，琼脂糖凝胶的有效分离范围降低。当溴酚蓝移动到距离胶板中央时，停止电泳。
5、观察和拍照：电泳完毕，取出凝胶。在波长为254nm的紫外灯下观察染色后（2）的或已加有EB的电泳胶板。DNA存在处显示出肉眼可辨的桔红色荧光条带。于凝胶成像系统中拍照并保存之。
五、注意事项
1、EB是强诱变剂并有中等毒性，易挥发，配制和使用时都应戴手套，并且不要把EB洒到桌面或地面上。凡是沾污了EB的容器或物品必须经专门处理后才能清洗或丢弃。简单处理方法为：加入大量的水进行稀释（达到/mL以下），然后加入倍体积新鲜配制的5%次磷酸（由50%次磷酸配制而成）和倍体积新鲜配制的/L 的亚硝酸钠，混匀，放置1天后，加入过量的1mol/L碳酸氢钠。如此处理后的EB的诱变活性可降至原来的1/200左右。
2、由于EB会嵌入到堆积的碱基对之间并拉长线状和带缺口的环状DNA，使DNA迁移率降低。因此，如果要准确地测定DNA的分子量，应该采用跑完电泳后再用μg/ml的EB溶液浸泡染色的方法。
六、实验报告要求与思考题
1、附上电泳结果的图片并进行正确的标注（如下图）
M：1Kb DNA ladder；1：质粒DNA
2、琼脂糖凝胶电泳中DNA分子迁移率受哪些因素的影响？
3、如果样品电泳后很久都没有跑出点样孔，你认为有哪几方面的原因？
4、为什么分子生物学实施时要担心EB？
5、琼脂糖凝胶电泳时胶中DNA是靠什么发出荧光的？为什么？
电泳流程图：
实验 PCR扩增eGFP基因
一、PCR技术的基本原理
PCR类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：
①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；
②模板DNA与引物的退火（复性）：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；
③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。(Plateau)。到达平台期所需循环次数取决于样品中模板的拷贝。
PCR 技术应用广泛，不可能有这样一套条件满足所有的实验，但本实验所介绍的方法可适应于大多数DNA 扩增反应，即使有的不适应，至少也确定了一个共同的起点，在此基础上可以作多种变化。不过下列因素在实验应用时应予以特别注意，以求取得满意结果。
1、模板：单、双链DNA 和RNA都可以作为PCR样品，若起始材料是RNA，须先通过逆转录得取第一条cDNA。虽然PCR 可以仅用极微量的样品，但为了保证反应的特异性，一般宜用ng 量级的克隆DNA，ug 级的染色体DNA，待扩增样品质量要求较低，但不能混合有任何蛋白酶、核酸酶，Taq DNA聚合酶的抑制剂以及能结合DNA 的蛋白质。
2、引物：引物是决定PCR 结果的关键，下列原则有助于引物的合理设计。（1）尽可能选择碱基随机分布，GC 含量类似于被扩增片段的引物，尽量避免具有多聚嘌呤、多聚嘧啶或其它异常序列的引物。（2）避免具有明显二级结构（尤其是在引物3'—末端）的序列。
3、防止引物间的互补，特别要注意避免具有3'末端重叠的序列。
4、引物的长度约为20个碱基，较长引物较好，但成本增加，短引物则特异性降低。
5、引物浓度不宜偏高，过高易形成二聚体解链；然后冷却至37—55℃，使引物与模板退
二、实验试剂
（一）仪器与器皿
PRC 扩增仪，琼脂糖凝胶电泳设备，微量取样器，一次性eppendorf管，凝胶成像仪
（二）试剂与材料
1、琼脂糖凝胶电泳试剂
1）电泳缓冲液：Tris—乙酸/L /L EDTA
2）加样缓冲液：%溴酚兰40% w/v蔗糖
3）溴化乙锭溶液：/ml溴化乙锭/水
4）琼脂糖
2、TaqDNA 多聚酶3、5´反应缓冲液：
125mmol/L Tris-HCl ；10mmol/L MgCl2；/ml gelatin；125mmol/L(NH4)2SO4； Formamide 25%
4、混合dNTP 液(dATP dGTP dTTP dCTP各 mmol/L)
5、DNA 模板
6、引物 1（10μmol/L）
7、引物 2（10μmol/L）
8、无菌水
三、实验步骤
1、按顺序在200μl 指形管中加入以下试剂与样品：（因购入的试剂批次不同，加样时有所差别，以预实验结果为准。
1）ddH2O 37μl
2）10*Buffer 5μl（含有MgCL2）
3）dNTP 2μl
4）引物1（上游）2μl
5）引物2（下游）2μl
6）模板 1μl（pEGFP质粒）
7）TaqDNA聚合酶1μl（）总体积共50μl
2、在PCR 扩增仪上按以下反应条件编入程序：（以下为参考值，因扩增的DNA片段不同，各类PCR 扩增仪程序设定各不相同，编程过程视扩增的DNA 片段的要求及仪器而定参数。）
1)预变性 94℃ 3 分种
2)循环条件（30 次）
变性 94℃ 30 秒
复性 55℃ 30 秒
延伸 72℃ 1分
3)延长延伸 72℃ 7 分钟
编完反应程序，置反应管于PCR扩增仪的反应孔中，开动机器，扩增循环反应开始。
3、PCR 扩增完毕，配%琼脂糖凝胶，电泳观察结果。
4、凝胶成像仪或紫外灯下观察实验结果，是否已扩增到实验设计的DNA片段
四、习题
1、PCR反应液中主要成分是哪些？在PCR反应过程中各起什么作用？
2、为什么在PCR反应过程中，使用三个不同的温度变化？
3、用PCR扩增目的基因，要想得到特异性产物需注意哪些事项？
实验 从动物组织（猪肝）中提取DNA
一、实验内容
采用SDS裂解和蛋白酶K消化法从猪肝中提取DNA，并进行琼脂糖凝胶电泳分析。目的
（1）掌握SDS裂解法从猪肝中的原理和方法；(2)巩固DNA的琼脂糖凝胶电泳分析实验。
二、实验原理
DNA是一切生物细胞的重要组成成分，主要存在于细胞核中。通过研磨和SDS作用破碎细胞；苯酚和氯仿可使蛋白质变性，用其混合液（酚：氯仿：异戊醇）重复抽提，使蛋白质变性，然后离心除去变性蛋白质；RNase降解RNA，从而得到纯净的DNA分子。
三、实验材料
新鲜猪肝
TES 缓冲液 ： Tris-HCl 10 mmoL/L ， EDTA 1mmoL/ L ， SDS mmoL/ L
四、实验步骤
1、剪取约肝脏组织，放入到研钵中磨碎；
2、向研钵中再加入1 ml TES轻轻研磨，将TES与破碎的组织混匀；
3、吸取535 µl组织匀浆液于2 ml EP管中，再加入60 µl SDS（10%）， µl蛋白酶K，充分混匀后，于56°C保温1 h，每30分钟轻摇1次；
4、放置到室温，加入等体积饱和酚（600µl），颠倒混匀，11000 rpm，离心10 min，吸取400 µl水相，并转移至一个新的 ml离心管中；
5、加入2倍体积（1000 µl）的无水乙醇和1/10倍体积（40 µl）3 M 醋酸钠沉淀DNA，12000 rpm离心10 min，弃乙醇；
6、加入适量TE溶解DNA和RNAse A（具体依DNA的多少而定），并利用%的琼 脂溏进行电泳分析。
五、注意事项
1、在将猪肝剪碎前要将猪肝清洗干净，除去脂肪及系膜成分。
2、抽提每一步用力要柔和，防止机械剪切力对DNA的损伤。
3、取上层清液时，注意不要吸起中间的蛋白质层。
4、乙醇漂洗去乙醇时，不要荡起DNA。
5、离心后，不要晃动离心管，拿管要稳。
6、在乙醇沉淀后，经离心要观察留在EP管中的小白点，其主要成分就是DNA，在以后的实验中都要细心观察，防止因将小白点丢失。
六、习题
1、为了获得高质量的肝脏DNA，在实验过程中应注意什么。
2、结合本人操作体会，总结在提取过程中如何避免大分子DNA的降解。
3、核酸提取中，去除蛋白质的方法有哪些？ 实验 限制性内切酶切割DNA
一、实验目的
1． 通过对DNA的酶切，学会设计构建体外重组DNA分子； 2． 根据目的基因合理选择载体与限制性内切酶； 3． 掌握DNA的酶切技术。
二、实验原理
限制性内切酶是从细菌中分离出来的一种能在特异位点切割DNA分子的核酸内切酶，目前已从多种细菌中分离出超过400种，识别各自不同的核苷酸顺序，这一顺序大多为具有一对称中心的回文序列，如从大肠杆菌中分离的 EcoR I识别„GAATTC„ 切割后产生„CTTAAG„、„G 和
AATTC„的末端，„CTTAAG„该末端由于有一段小的能互补配对的单链突出，故称为粘性末端。切割后的末端为3’-OH和5’-磷酸基团，即„G-OH和„CTTAA-P。
有的限制性酶识别四碱基对的顺序，如 San3A识别„GATC „；有的识别六
碱基对，如上述的ECOR I。识别四碱基对的内切酶由于识别顺序在DNA出现的频率更高（四碱基酶为44=256，六碱基酶为46＝4096），因而可将DNA切割成更小的片段，而识别八碱基对的Not I„GCGGCCGC„、„CGCCGGCG„ 则识别和切割位点更少（48＝65536），但碱基并不以均等的概率出现，因而切割后产生的片段变化范围很大。
＋
限制性内切酶作用的温度一般为37℃，反应体系中以Mg2为唯一的辅助因子，且要求pH缓冲在左右。
商品酶都保存在50％的甘油溶液中，-20℃贮存，活性通常较高，5u/μl（每单位即最适条件下1小时内完全酶解1μg DNA的酶量）。
三、实验材料
待酶切的DNA样品
四、实验仪器、器皿及试剂
1、仪器：可调微量加样器、恒温水浴箱、电泳仪、电泳槽、紫外检测灯
2、器皿：Eppendorf管、Tip、试管架
3、试剂：标准DNA(Marker)
EcoRI限制性内切酶
10×buffer：50mmol/l NaCl
10mmol/l Tris-HCl()
10mmol/l MgCl2
lmmol/l
DTT（二硫苏糖醇）
五、实验步骤
1、将DNA样品μl（质粒pEGFP, 1μg）
2、加入1μl 10×buffer，酶解buffer由厂家提供。
3、加入1u（μl）的限制性内切酶EcoRI（限制性酶很昂贵，从-20℃取出要置于冰上，吸取要新的Tip头，以免污染杂质，吸完后尽快放回冰箱）。
4、混匀反应液后，稍离心使液体聚集，置37℃温育1小时。
5、进行电泳检查酶切结果，100V 25分钟。
6、紫外灯下观察消化效果。
六、注意事项
1、分子生物学实验大多为微量操作，DNA样品与限制性内切酶的用量都极少，必须严格注意吸样量的准确性以保证酶切效果最佳。现介绍三种微量取样方法：
（1）吸样时，将Tip尖刚刚接触到液面时，轻轻吸取。此法可吸取~μl的样品，注意不要将Tip尖全部插入溶液，这样Tip壁上会沾上很多的样品，导致吸样不准。
（2）用1cm长的塑料毛细管代替Tip吸样，此法也可吸取~μl的样量。
（3）目前也有细长Tip出售，专门用于吸取微量样品。
2、限制性内切酶价格比较贵，因此要注意不使其污染而导致浪费。这就要求每次吸酶时要用新的无菌Tip。另一个造成限制性内切酶浪费的因素就是限制性内切酶的失活。因此，要注意加样次序，即各项试剂加好后，最后才加酶，并要在冰上操作，且操作要尽可能快，以使限制性内切酶拿出冰箱的时间尽可能短。
若用同一酶消化很多样品时，可先计算出所需酶量（可稍多计一点），取出此量的酶与1×缓冲液混合，然后再分装至各个反应管内。这样可节约用酶且缩短操作过程、减少污染机会。
3、开启Eppendorf管时，手不要接触到管盖内面，以防杂酶污染。
4、样品在37℃与65℃保温时，要注意将Eppendorf管盖严，以防水进入管内造成实验失败。
5、无实验必要应尽量避免长时间酶消化样品。因长时间消化，限制酶溶液中可能存在的杂酶会影响试验结果。
七、习题
1、限制性核酸内切酶天然存在于什么生物体内？
2、什么是细菌的限制-修饰系统？限制-修饰系统对细菌有什么用途？
3、限制性内切酶有几类？这几类限制性内切酶各有什么特点？可作为工具酶的限制性内切酶是哪一类？为什么？
4、限制性内切酶的识别序列有什么特点？称为什么序列？
5、酶通常在什么温度中保存？为什么酶在该温度下保存不会结冻？酶最后工作的时候其甘油浓度必须低于多少？ 6、1个单位（1 U）的限制性内切酶代表什么意思？
实验 质粒的转化
一、实验目的
掌握热激法或电转化法转化大肠杆菌感受态细胞及转化子的鉴定方法。实验材料：质粒DNA；大肠杆菌感受态细胞。
二、实验原理
质粒的转化是指将质粒或以它为载体构建的重组子导入细菌的过程。将连接产物转化到感受态细胞中，实现重组克隆的增殖，便于后续分子操作。可以采用多种方法筛选和鉴定目的克隆。
（1）热激法：大肠杆菌在0℃ CaCl2低渗溶液中，菌细胞膨胀成球形，转化混合物中的DNA形成抗DNase的羟基－钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经42℃短时间热冲击处理，促进细胞吸收DNA复合物，在丰富培养基上生长数小时后，球状细胞复原并分裂增殖。在被转化的细胞中，重组子基因得到表达，在选择性培养基平板上可挑选所需的转化子。
（2）电转化法：外加于细胞膜上的电场造成细胞膜的不稳定，形成电穿孔，不仅有利于离子和水进入细菌细胞，也有利于孔DNA等大分子进入。同时DNA在电场中形成的极性对于它运输进细胞也是非常重要的。
三、实验步骤
1、制备选择性培养基平板：在融化的250ml LB固体培养基中（冷却止55摄氏度以下）加入Amp至终浓度50μg/ml，混匀后倒入灭菌培养皿中；
2、取出1管制备好的感受态细胞，放在冰上融化；
3、每100μl感受态细胞加入约20ng质粒DNA，轻轻混匀，在冰上放置30分钟；
4、热击：将离心管放置42℃水浴，热击90秒，注意：勿摇动离心管；
5、冰镇：快速将离心管转移至冰浴，放置1－2分钟；
6、复苏：每管加400 μl LB培养基，在37℃摇床温和摇动温育45分钟，使细菌复苏；
7、布皿：取适当体积均匀涂布于含有、抗生素（Amp）的LB平板；
8、培养：倒置培养皿，于37℃培养12－16小时即可观察到白色的菌落，即为转化子。
四、结果与分析
计算转化效率
菌落数/DNA质量（μg）*稀释倍数
五、习题
1、制备感受态细胞的关键是什么？
2、如果DNA转化后，没有得到转化子或者转化子很少，分析原因。
3、如何提高转化效率？
它山之石可以攻玉，以上就是差异网为大家带来的5篇《分子生物学实验步骤总结超全》，希望可以对您的写作有一定的参考作用。
分子生物学实验方案2
实验一 分子生物学实验安全注意事项及分子生物学实验室所需要的仪器设备的使用（2学时）实验二 分子材料的采集、保存和植物/动物基因组DNA 的分离（8学时）实验三 DNA/RNA 的琼脂糖凝胶检测（4学时）实验三 聚合酶链式反应（PCR）（3学时）
实验四 PCR产物的琼脂糖凝胶检测与聚丙烯酰胺凝胶电泳检测（6学时）实验五 分子生物学软件的使用（4学时）
实验六 生物信息学（3学时）生物信息获取与利用 实验考试
实验三：琼脂糖凝胶电泳检测DNA
目的要求
学习并掌握DNA琼脂糖凝胶电泳基本原理和操作，了解如何通过电泳判断DNA纯度、含量和分子量。
实验原理
凝胶电泳是分离、纯化和鉴定DNA的常用方法。因为DNA分子是两性解离分子，在pH高于其等电点（约）的中性或碱性溶液中带负电荷，在电场中向正极方向泳动。DNA凝胶电泳的介质主要有两种：琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶。聚丙烯凝胶的孔径较小，适合于分离5-500bp的小片段DNA；而琼脂糖凝胶的孔径较大，可以分离100bp-60kb的较大片段DNA。不同浓度的琼脂糖凝胶适合于分离不同大小的DNA片段（表7-1）。
琼脂糖是从海藻中提取出来的一种线状高聚物，当熔化后再凝固时就会形成固体基质，具有多孔的网状结构，孔径大小取决于琼脂糖浓度。DNA在琼脂糖凝胶中泳动时，受到电荷效应和分子筛效应的双重影响。电荷效应由分子所带的电荷量多少来决定，而分子筛效应则与分子大小和构象有关。在一定的电场强度下，DNA分子的泳动速度主要取决于分子量大小和构象。线状双链DNA分子在琼脂糖凝胶介质中的迁移率与其分子量的对数值成反比。分子越大，迁移速度越慢，从而可以将不同大小的DNA分子分开。因此，通过与DNA标准分子量参照物（MW marker）的迁移率对照，可以鉴定DNA分子的大小。DNA分子的构象也可以明显影响其迁移率。在细胞内质粒DNA有3种构象：超螺旋的共价闭环DNA（covalently closed circular DNA，cccDNA），松弛型的开环DNA（open circular DNA，ocDNA）和线性DNA，在琼脂糖凝胶电泳中，其泳动速度依次为：cccDNA>线性DNA>ocDNA，因而未酶切的质粒DNA在电泳中多显示为3条带，泳动速度最快的超螺旋带越亮，说明质粒DNA提取质量越好。
表7-1：不同浓度琼脂糖凝胶对DNA的有效分离范围
琼脂糖浓度（%）线性DNA有效分离范围(kb) 5-60 1-20 DNA的迁移率还与电场强度（即单位长度的电压降）有关，电场强度越大，泳动速度越快。当需要快速观察电泳结果时，可以适当加大电场强度。但是电泳分辨率会随着电场强度的增大而缩小，因为高分子高速流动时摩擦力增加，相对分子质量与移动速度就不一定成正比，因此一般电场强度应不超过5V/cm。特别是当需要较精确测定DNA片段大小、获得理想的分辨率和漂亮的带型时，应该适当降低电场强度，相应的适当延长电泳时间，并选用相对较低的凝胶浓度。
为了显示凝胶中DNA的泳动位置，需要加入染色剂染色。最常用的染色剂是溴化乙锭（ethidium bromide EB）。溴化乙锭可以嵌入核酸双链的配对碱基之间，在紫外线的激发下发出橘红色荧光。一般是在凝胶中直接加入终浓度为μg/ml的溴化乙锭，这样可以在电泳过程中随时利用紫外灯观察核酸的迁移情况。但是EB与DNA的结合会影响DNA的迁移率，因此对于需要较精确测定DNA片段大小、或需根据荧光强度测定DNA含量时，EB染色应在电泳结束后再进行（将凝胶浸入μg/ml的溴乙锭水溶液中10min即可）。注意：EB是强诱变剂，使用EB必须戴一次性手套，不要洒在桌面地面上，被污染的物品必须专门处理后（加少量漂白粉可使EB分解），再彻底清洗或丢弃。
指示剂溴酚蓝和二甲苯青的作用是指示样品在凝胶中的迁移过程，以确定终止电泳时间。在 %、1%、2%琼脂糖凝胶电泳中，溴酚蓝分别约与1kb、600bp、150bp双链线状DNA片段的迁移率大致相同。在1%琼脂糖凝胶中，二甲苯青大致相当于2kb双链线状DNA的位置。试剂器材
1．5×TAE：
2．10mg/ml溴化乙锭（EB），避光4℃保存。/ GoldView 常温保存。3．6×上样缓冲液（配方见附录）4．（电泳）琼脂糖
5． DNA、PCR扩增产物
6．DNA标准分子量marker（λDNA/HindIII）7．水平式电泳槽、电泳仪 8．透射式紫外灯 9．胶带
10．微波炉或恒温水浴 11．微量移液器 操作步骤
1．称取琼脂糖1g，置三角烧瓶中，加入1×TAE 100 ml，置沸水浴或微波炉中加热，使充分溶解。注意：微波炉煮沸1次可能不能充分溶解，需取出混合后反复加热1-2次，注意此时可能出现爆沸现象，避免蒸汽烫伤。
2．待琼脂糖溶液冷却至60-65℃左右时加入溴化乙锭/5ulGold View，使终浓度为μg/ml，混匀。
3．用胶带把制胶模具的两端边缘封好，置水平位置，选择孔径适宜的加样孔模板（梳子），并垂直安插好。注意梳齿必须与模具底面保持一定距离（约），防止样品槽破裂，导致样品泄漏。
图3-1：凝胶灌胶过程示意图
4．将冷却至50-60℃左右的琼脂糖溶液缓慢倒入制胶模具中，使凝胶液缓慢展开，直至形成厚度适当（一般为）的胶层。小心去除加样孔周围的气泡。室温静置30-60分钟。（如图3-1）
5．琼脂糖完全凝固后，小心取出梳子，去掉模具两端的胶带，将凝胶放入电泳槽中。6．电泳槽中注入适量×TBE缓冲液，使液面高于凝胶约1mm左右。7．分别取5μl DNA或者2μl PCR产物和约μg DNA分子量marker，加入1/5体积（2ul）的上样缓冲液，混匀。
8．小心缓慢将样品上样于凝胶加样孔中。记录样品加样孔顺序。
9．上样完成后，尽快开始电泳，以防止样品漂流。接通电源，注意正负极是否正确。调节电压在1-5V/cm左右，样品进胶前电压不要太高。电泳开始后不久就可以观察到溴酚蓝从加样孔迁移到凝胶中。
10．根据指示剂迁移的位置，或根据反射紫外灯显示的DNA迁移位置，判断是否需要终止电泳。切断电源后，取出凝胶。
11．将凝胶置于透射紫外灯上，打开紫外灯（注意尽量避免使用254nm短波紫外灯，并戴好防护眼镜或防护罩），观察染色后发出橘红色荧光的DNA条带，拍照记录。
注意观察样品DNA条带是否清晰，有无拖尾现象，条带数量、大小是否正确，判断样品DNA分子大小，与预期大小是否相符，并目测粗略估算样品DNA含量。注意事项
（1）凝胶不能有气泡。（2）电泳是从负极到正极。
（3）EB是致癌剂，操作要带手套。实验安排
本实验一天内可做完。作业
写出实验步骤及注意事项。
相关溶液配制
1,50倍TAE缓冲液的配制()配方：2MTris-HAc、100mM EDTA 配制量：1L 配制方法：
1）称取Tris碱，置于烧杯中
2）称取EDTA固体或Na2EDTA-2H2O固体 3）加入700mLddH2O，溶解完全 4）加入57mLHAc，充分搅拌 5）用HAc调pH至 6）定容至1L，室温保存
2，溴化乙锭(EB)强致癌物 配制量：100mL 配制方法：
1）1gEB于专用容器中
2）加入100mLddH2O,搅拌数小时至溶解完全 3）转移至棕色瓶中，避光保存 3，6×上样缓冲液Loading Buffer 配方：30mMEDTA；36%（V/V）丙三醇；%溴酚蓝； 配制量：100mL 配置方法：
1）6mL EDTA（500mM，）加入50ml ddH2O中 2）5mL 1%溴酚蓝 3）取36mL丙三醇
4)用2N的NaOH调pH= 5）定容至100mL 4，6×甘油上样缓冲液Loading Buffer 配方、配制量：
成分及终浓度 %溴酚蓝
%二甲苯靑EF 5mmol/L EDTA 50%甘油 水
配制10ml溶液各成分用量 1%溴酚蓝
1%二甲苯靑EF
100ul /L EDTA()3ml
(GV)GoldView(GV)是一种可代替溴化乙锭（EB）的新型核酸染料，其灵敏度与EB相当，使用方法与之完全相同，在100ml琼脂糖胶溶液中加入5µl GoldView™即可。在紫外透射光下双链DNA呈现绿色荧光，也可用于染RNA。
由于未发现GoldView™有致癌作用，且灵敏度与EB相当，将有可能逐渐取代EB而得以广泛应用。
概 述
GoldView™是一种可代替溴化乙锭（EB）的新型核酸染料，采用琼脂糖电泳检测DNA时，GoldView™与核酸结合后能产生很强的荧光信号，其灵敏度与EB相当，使用方法与之完全相同。在紫外透射光下双链DNA呈现绿色荧光，而且也可用于染RNA。
通过Ames试验、小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验、小鼠睾丸精母细胞染色体畸变试验，致突变性结果均为阴性；而溴化乙锭（EB）是一种强致癌剂。因此用Goldview™代替EB不失为一种明智的选择。
使用方法
1、将100ml琼脂糖凝胶溶液（浓度一般为%~2%）在微波炉中融化。
2、加入5ul GoldView，轻轻摇匀，避免产生气泡。
3、冷却至不烫手时倒胶，待琼脂糖凝胶完全凝固后上样电泳。
4、电泳完毕在紫外灯下观察。若使用数码相机照相记录，则关闭相机的闪光灯，放在自动档即可；若使用凝胶成像系统照相，通过调节光圈、曝光时间，选择合适的滤光片，可得到成像清晰、背景较低的照片。
注意事项
1、胶厚度不宜超过，胶太厚会影响检测的灵敏度。
2、加入GoldView的琼脂糖凝胶反复融化可能会对核酸检测的灵敏度产生一定影响，但不明显。
3、通过凝胶电泳回收DNA片段时，建议使用GoldView染色，在自然光下切割DNA条带，避免紫外线与EB对目的DNA产生的损伤，可明显提高克隆、转化、转录等分子生物学下游操作的效率。
4、虽然未发现GoldView有致癌作用，但对皮肤、眼睛会有一定的刺激，操作时应戴上手套。
分子生物学实验总结3
分子生物学实验
全自动灭菌锅的使用
（1）检查排放蒸汽的水壶，腔体内的水位与托板齐平。（2）SET键设置温度和时间（121℃，20min）（3）关闭排气阀，Start机器开始运行，Check Heat检查设置的温度，Stop键终止机器运行。（4）程序运行结束，旋开排气阀或机器自行排气至压力为0。温度降至80℃以下压力为0时方可开盖。运行过程中勿接触盖子。（5）腔体内经常清洁。液体培养基（1000mL）
将胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g完全溶解在950mL去离子水中，用NaOH调节pH至，加入去离子水至总体积为1000mL，121℃湿热灭菌20min。冷却后4℃保存备用。固体还要再加琼脂。3.碱裂解法
碱裂解法提取质粒是根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体DNA在拓扑学上的差异来分离它们的。在pH值介于～这个狭窄的范围内，线性的DNA双螺旋结构解开而被变性，尽管在这样的条件下，共价闭合环状质粒DNA的氢键会断裂，但两条互补链彼此缠绕，仍会紧密的结合在一起。当加入 的乙酸钾高盐缓冲液，恢复pH至中性时，共价闭合环状质粒DNA的两条互补链仍保持在一起，因此复性迅速而准确，而线性的染色体DNA的两条互补链彼此完全分开，复性就不会那么迅速而准确，它们缠绕形成网状结构。通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA，蛋白质－SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。
溶液Ⅰ：葡萄糖，Tris-HCl，EDTA 葡萄糖能增加溶液的黏度，防止DNA受机械作用而降解。EDTA可螯合Mg2+、Ca2+等金属离子，抑制DNase对DNA的降解作用。溶液Ⅱ：氢氧化钠，SDS 氢氧化钠加入后碱性环境促使染色体DNA与质粒的变性解离成单链。SDS是一种阴离子去垢剂，它的主要作用有：①溶解细胞膜上的脂肪与蛋白，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜；②解聚细胞中的核蛋白，使蛋白质与DNA分开；③SDS能与蛋白质结合成为SDS-蛋白质复合物，使蛋白质变性而沉淀；④SDS能抑制核酸酶的作用，防止对DNA的降解。
溶液Ⅲ：乙酸钾。用的KAc溶液是为了调整溶液pH至中性，使变性的质粒DNA能够复性，并能稳定存在。而高盐的3mol/L醋酸钾(KAc)有利于变性的大分子染色体DNA、RNA以及SDS-蛋白质复合物凝聚而沉淀。 buffer 电泳指示剂溴酚兰在碱性液体中呈紫兰色，一般与蔗糖、甘油组成上样缓冲液。作用：①增加样品比重，以确保DNA均匀沉入加样孔内。②形成肉眼可见的指示带，预测核酸电泳的速度和位置。③使样品呈色，使加样操作更方便。5.限制性内切酶（I型）限制性内切酶：能识别专一的核苷酸顺序，并在识别点附近的一些核苷酸上切割DNA分子中的双链，但是切割的核苷酸顺序没有专一性，是随机的。
（II型）限制性内切酶：能识别专一的核苷酸顺序，并在该顺序内的固定位置上切割双链。这类限制性内切酶的识别和切割的核苷酸都是专一的，因此，这种限制性内切酶是DNA重组技术中最常用的工具酶之一。
（III型）限制性内切酶：也有专一的识别顺序，但不是对称的回文顺序，在识别顺序旁边几个核苷酸对的固定位置上切割双链。但这几个核苷酸对不是特异性的。因此，这种限制性内切酶切割后产生的一定长度DNA片段，具有各种单链末端。因此不能应用于基因克隆。6.引物设计和选择目的DNA序列区域时遵循下列原则： 引物长度约为16～30bp；引物中G+C含量通常为40%～60%，可按Tm＝4(G+C)+2(A+T)粗略估计引物的解链温度；四种碱基应随机分布，在3’端不存在连续3个G或C，因这样易导致错误；引物3’端最好与目的序列阅读框架中密码子第一或第二位核苷酸对应，以减少由于密码子摆动产生的不配对；在引物内，尤其在3’端应不存在二级结构；两引物之间尤其在3’端不能互补，以防出现引物二聚体，减少产量；引物5’端对扩增特异性影响不大，可引入酶切位点或突变位点；引物不与模板结合位点以外的序列互补；简并引物应选用简并程度低的密码子；引物的浓度一般为～μmol/L，引物浓度偏高会引起错配和非特异性产物扩增，引物浓度偏低则降低产量。 常用的浓度为20～200μmol/L，而且4种dNTP的终浓度相等，以减少合成中由于某种dNTP的不足而出现的错误掺入；dNTP浓度过高虽可加快反应速度，但会增加碱基的错误掺入率，同时会抑制Taq DNA聚合酶的反应活性；适当的低浓度会提高反应的精确度；注意协调Mg2+浓度和dNTP浓度之间的关系。8.感受态
处于对数生长期的细菌经低温CaCl2处理后接受外源DNA的能力显著增加。细菌处于容易吸收外源 DNA的状态叫感受态。在自然条件下，很多质粒都可通过细菌接合作用转移到新的宿主内，但在人工构建的质粒载体中，一般缺乏此种转移所必需的mob 基因，因此不能自行完成从一个细胞到另一个细胞的接合转移。如需将质粒载体转移进受体细菌，需诱导受体细菌产生一种短暂的感受态，以摄取外源DNA。9.转化
转化是将外源DNA 分子引入受体细胞，使之获得新的遗传性状的一种手段。转化过程所用的受体细胞一般是限制修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变体(R-,M-)，它可以容忍外源DNA 分子进入体内并稳定地遗传给后代。它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。连接酶
有两种：T4噬菌体DNA连接酶和大肠杆菌DNA连接酶；DNA重组的方法主要有粘端连接法和平端连接法，为了防止载体本身的自连，可以通过牛小肠碱性磷酸酶CIP处理克服； 连接反应的温度在37℃时有利于连接酶的活性。但是在这个温度下，粘性末端的氢键结合是不稳定的。因此人们找到了一个折中的温度，即12～16℃，连接12～16h（过夜），这样既可最大限度地发挥连接酶的活性，又兼顾到短暂配对结构的稳定；
pMD18-T Vector 是一种高效克隆PCR 产物（TA Cloning）的专用载体，该载体由pUC18 载体改建并在其3’端添加“T”而成
大部分耐热性DNA聚合酶进行PCR反应时都有在PCR产物的3’末端添加一个“A”的特性，所以使用本制品可以大大提高PCR产物的连接、克隆效率；
转化是指质粒DNA或以它为载体构建的重组子导入细菌的过程 11.α互补
重组质粒转化宿主细胞后，还需对转化菌落进行筛选鉴定。利用α互补现象进行筛选是最常用的一种鉴定方法； α互补：质粒载体上lacZ’基因编码的α肽段与失去了正常氨基端的β-半乳糖苷酶突变受体菌之间实现互补的现象，由α互补而形成的有功能活性的β半乳糖苷酶，可以用Xgal显色测定出来；任何携带着lacZ’基因的质粒载体在转化β半乳糖苷酶突变的大肠杆菌细胞后，在含有Xgal的培养基平板上形成蓝色菌落，而含有重组质粒载体的克隆往往是白色菌落。
超英分子生物学实验4
超英生物实验室分子生物学系列服务项目
1、DNA提取（组织、细胞、血液、蜡块），质粒提取，基因克隆、纯化。
2、蛋白提取、定量。原核及真核基因蛋白表达纯化（盐析与透析）、分析鉴定、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，western-blot（常规DAB显色及化学发光）
蛋白组学相关技术
免疫蛋白质印迹(Western blotting)是根据抗原抗体的特异性结合检测复杂样品中的某种蛋白的方法。
3、总RNA提取 定量、电泳。总RNA是一种非常重要的试验材料。本公司可以提供从多种材料中提取总RNA的服务。常见的有：血液、培养细胞、动物组织、植物
4、聚合酶链反应（PCR）
5、RT-PCR：组织或细胞中的总RNA,以其中的mRNA作为模板，采用Oligo(dT)或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA.再以cDNA为模板进行PCR扩增，而获得目的基因或检测基因表达。降落PCR 引物设计及PCR相关实验
6、细胞培养、细胞冻存、原代细胞的分离与培养、细胞转染及细胞生物学相关技术
7、细胞凋亡检测（TUNEL,单细胞凝胶电泳等）
8、细胞周期调控，同步化细胞
9、特殊的细胞爬片材料，提供检测爬片细胞的特异性抗体检测，客户所感兴趣的基因检测
(RISH,DISH,IS-PCR,PRINS)
分子生物学实验步骤总结超全（共5
一 目的基因的获得 细菌基因组DNA的提取
（一）仪器 1）台式高速离心机 2）恒温水浴箱 3）枪式移液器 4）灭菌的EP管和Tip头
（二）试剂
1）溶液1: 25% 蔗糖
50mmol/L Tris-Hcl， 50mmol/L
EDTA， 500ug/ml
溶菌酶（现用现配）
100ug/ml
RNase 2)溶液Ⅱ：100mmol/L
Tris-Hcl，
1%
SDS
400ug/ml
蛋白酶K 3）酚：氯仿：异戊醇（25：24：1）4）氯仿：异戊醇（24：1）5）3mol/L NaAc()6）异丙醇或无水乙醇 7）70%乙醇
8)TE缓冲液： 10mmol/L
Tris-Hcl，
1mmol/L
EDTA，(三)实验步骤
1)5mL细菌过夜培养，5000rpm离心10分钟，去上清液。2）将菌体细胞悬于250uL溶液1中，37°C水浴保温过夜。3）加250uL溶液Ⅱ，55°C水浴保温4小时。
4）加倍体积的酚/氯仿/异戊醇（25：24：1），轻轻混匀，于14000rpm离心10分钟，转移水相至新的Ep管，重复步骤4一次。
5）向转移的水相中加入0,9倍体积的氯仿/异戊醇（24：1），轻轻混匀，于14000rpm离心10分钟，转移水相至新的Ep管，重复步骤5一次。
6）向转移的水相中加入倍体积的3mol/L NaAc和倍体积的异丙醇（或倍体积的无水乙醇），冰上放置30分钟。
7）14000rpm离心20分钟，弃上清，用%乙醇洗涤沉淀一次，弃上清，沉淀于室温干燥。
8）将DNA沉淀溶解于15ul TE缓冲液中，-20°C保存。9）进行DNA含量和纯度检测，琼脂糖凝胶电泳鉴定。
植物DNA的SDS提取法：
（一）试验试剂：
1）研磨缓冲液：称取，柠檬酸三钠，－Na分别溶解后合并为一，用/L的NaOH 调至，并定容至1000ml。
2）10 SSC溶液：称取 和柠檬酸三钠，分别溶解，一起定容至1000ml。3）1 SSC溶液：用10 SSC溶液稀释10倍。4） SSC溶液：用1 SSC溶液稀释10倍。
5）Rnase溶液：用/LNaCl 溶液配制成25mg/ml 的酶液，用1mol/LHCl，pH至，使用前经80℃水浴处理5min（以破坏可能存在的Dnase）。6）氯仿－异戊醇：按24ml 氯仿和1ml 异戊醇混合。
7）5mol/L高氯酸钠溶液：称取NaClO4．H2O ，先加入少量蒸馏水溶解再容至100ml。8)SDS（十二烷基硫酸钠）化学试剂的重结晶：将SDS放入无水酒精中达到饱和为止，然后在70～80℃的水浴中溶解，趁热过滤，冷却之后即将滤液放入冰箱，待结晶出现再置室温下凉干待用。9)1mol／LHCl。10)/LNaOH。
11)二苯胺乙醛试剂：二苯胺溶于100ml 冰醋酸中，添加 浓硫酸，装入棕色瓶，贮存暗处，使用时加 乙醛液［浓乙醛：H2O＝1：50（V／V）］。12)/L高酸溶液（HClO4）。13)/LNaOH。
14)DNA标准液：取标准DNA25mg 溶于少量/L NaOH中，再用/LNaOH定容至25ml，后用移溶管吸取此液5ml 至50ml 容量瓶中，加/LHClO4，混合冷却后用/LHClO4定容至刻度，则得100μg/ml 的标准溶液。
（二）实验步骤： 1)称取植物幼嫩组织10g剪碎置研钵中，加10ml 预冷研磨缓冲液并加入左右的SDS，置冰浴上研磨成糊状。
2)将匀浆无损转入25ml 刻度试管中加入等体积的氯仿－异戊醇混合液，加上塞子，剧烈振荡30s，转入离心管，静置片刻以脱除组织蛋白质。以4000rpm离心5min。
3)离心形成三层，小心地吸取上层清液至刻度试管中，弃去中间层的细胞碎片、变性蛋白质及下层的氯仿。
4)将试管置72℃水浴中保温3min（不超过4min），以灭活组织的DNA酶，然后迅速取出试管置冰水浴中冷却到室温，加5mol/L高氯酸钠溶液［提取液：高氯酸钠溶液＝4：1（V／V）］，使溶液中高氯酸钠的最终浓度为1mol/L。
5)再次加入等体积氯仿－异戊醇混合液至大试管中，振荡1min，静置后在室温下离心（4000rpm）5min，取上清液置小烧杯中。
6)用滴管吸95％的预冷乙醇，慢慢地加入烧杯中上清液的表面上，直至乙醇的体积为上清液的两倍，用玻璃棒轻轻搅动。此时核酸迅速以纤维状沉淀缠绕在玻璃棒上。7)然后加入 左右的10 SSC，使最终浓度为1 SSC。8)重复第6步骤和第7步骤即得到DNA的粗制品。
9)加入已处理的Rnase溶液，使其最后的作用浓度为50～70μg/ml，并在37℃水浴中保温30min，以除去RNA。
10)加入等体积的氯仿－异戊醇混合液，在三角瓶中振荡1min，再除去残留蛋白质及所加Rnase蛋白，室温下以4000rpm离心5min，收集上层水溶液。11)再按6、7步骤处理即可得到纯化的DNA液。
二、PCR扩增目的基因
（一)器材 1）微量移液器
2)灭菌的Tip头、PCR管 3)PCR扩增仪
4)目的DNA（DNA模板）5)dNTP混合物 6)引物对 7)Tap酶
8)PCR扩增试剂盒
（二）试剂
1）10×PCR 缓冲液（含Tris-HCl 100mmol/L;MgCl2 15mmol/L、KCl 500mmol/L, ，%明胶）
2)脱氧核苷三磷酸dNTPs：配成 10mM—— dATP，dTTP，dGTP，dCTP各10mM，用NaOH溶液调节至。）
3）氯仿-异戊醇：配成24：1的比例，室温避光保存。4)酚：氯仿：异戊醇=25：24：1 5)3M NaAc、ddH2O 6)无水乙醇：70%乙醇 7)TE缓冲液
（三）实验步骤
1）在薄壁反应管中加入下列成份：（混匀）
ddH2O: 补至终体积（25μl）10×PCR缓冲液 1/10总体积 dNTPs 1μl
2U/μl Taq DNA聚合酶 μl
引物混合液（10 pmol /μl /引物）1μl
DNA模板 μl
混匀后，在台式离心机上瞬时离心10秒。2）在设定好的PCR仪上反应 95°C，5min；95°C，1min；56°C，1min；72°C，2min。反应30轮。
3）反应结束后，将反应管在72°C充分延伸10分钟，再将反应管冷却至4°C。取一部分反应液进行琼脂糖凝胶电泳（实验三），确认是否有目的的PCR产物。如果PCR产物纯度较低或反应液中含有连接反应阻碍物，可以通过纯化得到改善。纯化继续4）—6）。4）转至离心管，向管中加25μl酚，25μl氯仿-异戊醇混匀，离心10000rpm，30秒。5）吸取上层液，转至另一已加5μl 3M NaAc的的离心管，加150μl无水乙醇，-20°C过夜。
6）离心10000rpm，10分钟，弃上清，加 70%乙醇，10000rpm离心，5分钟。弃上清，烤箱中干（60°C），溶于20μl TE。
（四）技术要点
1）PCR各组份的配制与加样量要特别注意。
（1）引物浓度：10 pmol 足够30个循环，浓度太高导致与模板非特异结合增强，扩增非 特异片段增多，浓度太低则扩增效率低。
（2）引物的配制：厂家提供的引物一般是干粉状态并标明OD值，1 OD约含33μg。开盖前先将干粉离心至管底，加双蒸水至浓度2μg/μl，再取部分稀释至10 pmol /μl。引物浓度计算公式：1pmol=(×10μg)×n，n是引物的碱基数
(3)Mg：使用浓度一般在，要求模板不含高浓度EDTA和诸如硫酸基团类的负电荷基团，Mg浓度升高可导致错配率升高和非特异性扩增。
（4）模板DNA：浓度不可过高，质粒DNA 20ng即可，若需第二次扩增，可将第一次扩增产物稀释1000-10000倍作为模板使用。
(5)Taq DNA聚合酶：一般用量5U/100μl。酶量过大易导致扩增非特异序列，Taq酶具有末端转移酶活性，常在3’端加A。2）扩增轮数与退火温度
扩增轮数：一般30轮以内就可使模板扩增10倍，超过30轮，错配率升高。退火温度计算公式：Tm值=（GC×4+AT×2）–4
6-42+2+
三、琼脂糖凝胶电泳的检测
（一）仪器
1）琼脂糖凝胶电泳系统（天平、锥形瓶、量筒、微波炉、凝胶板、梳子、枪式移液器、灭菌Tip头、水平电泳槽、电泳仪）2）凝胶成像仪(二)试剂及材料
目的DNA、琼脂糖、蔗糖、溴酚蓝、硼酸、Tris、EDTA、EB、DNA纯化试剂
盒
1)TAE电泳缓冲液
浓储存液 50×：242g Tris；冰乙酸；100ml /L EDTA()
定容至一升。
使用液 1×： Tris；冰乙酸；2ml mol/L EDTA()定容至一升。2）样本液
10×缓冲液: 60%蔗糖；%溴酚蓝
（三）实验步骤
1）将有机玻璃内槽洗净、晾干，放置于水平制胶器中，插好梳子，在梳子底部与胶槽之间应保持几毫米的间隙。
2）%琼脂凝胶板的配制：取琼脂糖加80ml TAE（1×），20ml水，微波炉加热融化3分钟，将其冷却至55°C-65°C，加入EB储存液1ul，小心混匀，缓慢倒入制胶槽中。（根据目的基因的大小选择琼脂糖凝胶浓度）。
3）充分凝固后从制胶槽中卸下凝胶板，放入电泳槽，加入TAE（1×），使其液面略高于琼脂糖板，拨出样品梳。
4）DNA样品按照10：1的比例加入样本液，在腊面纸上混匀，用移液枪加样于琼脂糖板的样品孔中。同时另取一个DNA分子量标准上样于另一样品孔，在同一凝胶板上进行电泳。5）接通电泳槽与电泳仪的电源，维持稳压1-5V/cm（按照两极之间距离计算），电泳时间根据溴酚蓝指示剂迁移的位置来判断，当移动到距凝胶前沿1-2cm出停止电泳。6）剥胶并在凝胶成像仪观察结果。（四）技术要点
1）选择琼脂糖凝胶浓度取决于所鉴定DNA的大小，小片段DNA应用高浓度凝胶，大片段则用低浓度凝胶，在1%的琼脂糖凝胶中溴酚蓝的泳动速度与500bp的双链线状DNA一致。不同浓度琼脂糖凝胶及其可分离的线性DNA大小范围见下表1。表1 不同浓度琼脂糖凝胶及其分离线性DNA分子的有效范围凝胶浓度（%）
2）电泳中注意防止凝胶发热。
3）将电泳仪置稳压档，电压设置小于5V/cm（电极间的最小路径）。随着电压的增加，琼脂
糖凝胶的有效分离范围缩小。
4）溴化乙锭有强烈的致癌作用，操作时注意防护。
60～5 20～1 10～ 7～ 6～ 3～ 2～
分离DNA的有效范围（kb）
四、目的DNA的回收纯化
（一）仪器
1）琼脂糖凝胶电泳系统 2）凝胶成像仪 3）离心机 4）单面刀片 5）恒温水浴锅(二）试剂
1）DNA回收试剂盒 2）50×TAE 3）ddH2O(三)实验步骤
1）在紫外灯下切分含DNA的琼脂糖块，尽可能除去多余的琼脂糖．放入离心管中。2）按每100mg琼脂糖加入300—600μl 溶胶液的比例加入溶胶液（本实验加500ul），置55℃水浴10分钟，使琼脂糖块完全溶化，期间每2分钟颠例混匀一次促溶。3）将溶化后的琼脂糖液移入吸附柱，12000rpm 室温离心1分钟，倒掉收集管中的液体．再将吸附柱放入同一个收集管中。
4）在吸附杜中加入500uI漂洗液，室温静置1分钟后，12000rpm 室温离心30秒，倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管中。
5）再在吸附柱中加入500uI漂洗液，12000rpm 室温离心15秒，倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管中。6）12000rpm 室温空离心1分钟。
7）将吸附柱放入一个干净的的离心管中，在吸附膜中央加入30ul洗脱缓冲液，室温静置2分钟后，12000rpm 室温离心1分钟（为提高回收效率可再洗脱一次），将离心管(DNA)贮存于-20℃。
五、限制性内切酶消化、产物回收及连接重组
（一）仪器及材料 1）回收得到的目的DNA
2）BamHI、HindIII、T4 DNA连接酶、DNA回收试剂盒 3）pUC18‐CAT 质粒、双蒸水、10×酶切通用缓冲液K 4）EP管、恒温水浴锅、微量移液器、台式离心机
表1 常用酶切缓冲液配方
缓冲液名称
配 方
10×L
100mM
Tris-HCl, 100mM MgCl
210 mM DTT 10×M
100mM
Tris-HCl, 100mM MgCl2mM DTT 500mM NaCl 10×H
500mM
Tris-HCl, 100mM MgCl2mM DTT 1000mM NaCl 10×K
200 mM Tris-HCl, 100 mM MgCl2mM DTT 1000mM KCl 10×T（BSA－Free）
330mM
Tris-Ac, 100mM MgAc 5 mM DTT 660mM KAc
% BSA % Trition X-100
贮存温度（℃）-20
-20-20
(二）实验步骤
1）在灭菌的EP管中按如下方式准备双酶切反应体系： 酶切反应体系（20ul体系）
管号 核酸 10×酶切通用缓冲液K ddH2O BamHI
HindIII 1 15ul目的DNA
2ul
0ul
2ul
1ul 2
10ulpUC18‐CAT质粒 2ul 5ul 2ul 1ul 2)37℃保温三小时。
3)酶切产物的纯化回收，每100ul溶液加入700ul溶胶液，其余的操作步骤详见实验四 4)载体与目的DNA的连接。在灭菌的EP管中按如下方式准备双酶切反应体系（20ul）： 目的DNA pUC18‐CAT质粒 10×连接缓冲液 T4 DNA连接酶
ddH2O
X ul
Y ul
2ul
1ul
Zul 目的DNA和pUC18‐CAT质粒的相对浓度约为1:3—1:10 5）14℃水浴保温过夜。
六、大肠杆菌感受态细胞的制备及目的DNA的转化
（一）仪器
1．小型高速离心机 2．恒温摇床 3．恒温培养箱 4．‐20℃冰箱 5．恒温水浴器 6．超净工作台 7．高压灭菌锅(二)材料 1．氨苄青霉素 2．大肠杆菌DH5a 3．连接产物 4．离心管
5．枪头、微量移液器 6．试管、培养皿、三角瓶(三)试剂
LB 培养基（根据需要确定配制的量）：
10g/L 胰蛋白胨，5g/L酵母提取物，10g/L NaCl，加水至1000ml，高压灭菌，保存在室温。氨苄青霉素：
用去离子水配成100mg/ml的储存液，过滤除菌，－20℃分装保存。卡那霉素：
用去离子水配成100mg/ml的储存液，过滤除菌，－20℃分装保存 无抗生素LB琼脂糖平板培养基（根据需要确定配制的量）：
10g/l 胰蛋白胨，5g/l酵母提取物，10g/l NaCl，15g/l 琼脂粉，加水至1000ml，高压灭菌；铺平板，冷却后在37℃培养24小时，保存在室温。
含有抗生素LB琼脂糖平板培养基（根据需要确定配制的量）：
10g/l 胰蛋白胨，5g/l酵母提取物，10g/l NaCl，15g/l 琼脂粉，加水至1000ml，高压灭菌；当培养基降温至50℃左右，加入终浓度为100μg/ml 的氨苄青霉素或50μg/ml卡那霉素，并铺平板，冷却后在37℃培养24小时，保存在室温。 M CaCl2（根据需要确定配制的量）：
克溶解在1000ml灭菌水中，μm滤器过滤除菌。氯化钙分子量为：。50％甘油：
50ml甘油加入50ml水，混匀，高压灭菌。其他：
DH5α大肠杆菌，灭菌玻璃平皿若干，接菌环，加250ml LB液体培养基的1000ml灭菌锥形瓶一个，灭菌50ml和500 mL离心管若干，灭菌刻度吸管若干，冰盒，移液器，灭菌移液器吸头，灭菌Eppendorf管等。
（四）实验步骤
1）以接菌环从－70℃保存的高效转化菌种中蘸取少量菌液划无抗生素平板，培养12小时； 2）挑取单菌落接种于5 mL无抗生素LB培养基中，37℃振荡培养过夜；
3）按照1:100接种菌液至250 mL LB培养基中，37℃剧烈振荡培养 小时左右，至OD600达；
4）将菌液冰浴10 分钟，转移至预冷的500 mL离心管中，4℃，4000 rpm离心10 分钟； 5）弃上清，将细菌沉淀重新悬浮于50 mL预冷的 M CaCl2中，冰浴20 分钟，4℃，4000 rpm离心10 分钟；
6）弃尽上清。以 mL（菌液体积的5％）预冷的 M CaCl2溶液重悬细菌沉淀，同时加入等体积预冷的50%甘油水溶液，混匀后按每支50μL在冰上分装，－80℃保存； 注：以上操作全部在无菌条件下进行。
7）取连接产物2μl（在实际操作中，经常需要取全部连接产物）置于冰上； 8）从－80℃冰箱取3管感受态细菌（每管50μl），在冰上融化；
9）将连接产物加入感受态细菌中，混匀，放置冰上20－30分钟；同时做两个对照管
• 受体菌对照：50μl感受态细胞+2μl无菌水 • 质粒对照：50μ M CaCl2溶液+2μl连接产物 10）42℃加热90秒，迅速置于冰上1－2分钟；
11）每管加入400－1000μl的无抗生素液体LB培养基，在37℃摇床缓慢摇荡20－60分钟； 12）用<10000rpm离心10秒，弃去大部分上清，留下约50μl并用移液器吹吸重悬细菌； 13）取适量细菌悬液均匀的涂布在带有相应抗性（根据质粒所携带抗生素抗性基因而定）的LB琼脂糖平板上，倒置于37℃培养箱培养12小时以上，出现菌落。
（五）技术要点
1．加入的连接产物体积应该小于感受态细胞体积的5％； 2．42℃热激时，必须要保证温度的准确性；
3．涂布LB平板的菌液量应该根据经验确定。如果连接效率很高，而且所用感受态细菌的效率也很高，则吸取较少量的菌液；反之，可以增加，甚至全部菌液涂布平板。判断的标准：在LB平板上生长密度合适的单菌落；
4．涂布平板之后，在37℃培养的时间不超过12－16小时，否则可能产生卫星菌落； 5．防止其它质粒污染； 6．防止其它细菌污染。
七、质粒DNA的提取及重组子的鉴定
（一）仪器 1．恒温培养箱 2．恒温摇床 3．小型高速离心机 4．高压灭菌锅 5．分光光度计
（二）试剂及材料 1.转化重组子
2、缓冲液A：50mM葡萄糖；10mM EDTA；25mM Tris-HCl，。3.碱溶液： NaOH;1%SDS, 。
4、乙酸缓冲液：3M NaAC；2M乙酸，（盐酸调pH）。缓冲液：10mM Tris-HCl，；1mM EDTA.。
酶A溶液：10mg/ml RNA酶 A，用TE配制，100°C煮10分钟，灭活DNA酶。缓慢冷却至室温，10000r/min离心5min,上清于-20°C保存。
培养基: 10g胰蛋白胨，5g酵母粉，5g NaCl加水至1000ml，用1M NaOH调pH至，高压灭菌。
8、氨苄青霉素：用去离子水配成100mg/ml的储存液，过滤除菌，－20℃分装保存。培养基: 在LB培养基中加入终浓度100μg/ml的氨苄青霉素。10.异丙醇
11、酚-氯仿-异戊醇：25：24：1 %乙醇 NaAc
（三）实验步骤
1）从转化平皿上挑一克隆接种到LA液体培养基中，37℃震荡培养，待细菌浓度增至OD600=1—时，收获细菌。菌液转到管中，离心8000rpm，2分钟，弃上清。
2）加100μl缓冲液A，充分混悬细菌。
3）加200μl碱溶液，裂解细菌，反复倒转管5次至溶液清亮，开盖后能拉出丝状粘稠液体。4）加150μl乙酸缓冲液，反复倒转管5次，混匀，冰浴10分钟。5）离心10000rpm，5分钟，将上清转移至另一Eppendorf管中。
6）加等体积的酚-l氯仿-异戊醇（25：24：1）混匀，离心10000rpm，1分钟。7）吸上层水相至另一Eppendorf管中，加等体积的氯仿混匀，离心10000rpm，1分钟。8）吸上层水相至另一Eppendorf管中，加倍体积的异丙醇，混匀，室温或-20°C，10分钟。
9）离心10000rpm，10分钟，弃上清，加入1ml 70%乙醇。勿混匀，离心10000rpm，5分钟，重复加入1ml 70%乙醇一次，弃上清，干燥箱中干燥。
10）干燥后，加入30μl TE（含RNA酶A 10ul，20μg/ml），使质粒溶解，-20°C保存备用。11)取一个灭菌的EP管，依次加入下列试剂
10×限制酶缓冲液、重组质粒、ddH2O 、限制性内切酶总体积为。
12）将上述试剂轻轻混匀，稍加离心，集中溶液，37°C水浴保温3—4小时。酶切结束时，加入/L EDTA()使终浓度达10mmol/L，以终止反应。13）质粒DNA的琼脂糖凝胶电泳分析详见实验三。
（四）技术要点
1）每一步都要充分混匀，为获得高产量DNA，第一步需使菌体完全重悬。
2）加入碱溶液后，反复混匀使细菌充分裂解，但需要轻柔，一旦裂解（液体变清亮）必须马上加乙酸缓冲液中和。
3）70%乙醇洗涤时，离心后应小心地将上清倒掉，注意这时DNA沉淀较疏松，易从管壁上脱落。
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