凝胶色谱法（精选4篇）

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凝胶色谱法【第一篇】

关键词 间苯二甲酸二辛酯；气相色谱-质谱联用法；食品塑料；包装材料；检测；加标回收率

中图分类号 +1 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2016）19-0273-02

为了改变材料的功能或性质，在食品包装材料和容器的生产过程中通常会添加一些化学助剂，其直接与食品接触后会迁移到食品中，这其中最引入关注的就是增塑剂[1]。目前，这类物质的主要代表就是邻苯二甲酸酯类增塑剂（Phthalate Esters，PAEs）化合物，它们对人类产生的影响，主要表现为改变人体内分泌系统的正常功能，并对人体内未受损的器官或其后代造成不利影响。该类物质发挥着类似雌性激素的作用存在于人体和动物体内，它不仅使女性患乳腺癌的几率增加，而且甚至还会危害她们将来生育男婴的生殖系统[2-3]；同时，它还可减少男性的量和数量，甚至导致癌。

2011年的“起云剂”和2012年的白酒“塑化剂”等重大食品安全事件都是由邻苯二甲酸酯类化合物引起的，因此人们对这类物质的关注都很高。与邻苯二甲酸酯结构相似的间苯二甲酸酯也是一类十分重要的化工原料，广泛用于生产塑料、涂料、油漆、化学纤维等。间苯二甲酸酯类物质被列为环境激素类物质，因为它可能具有致癌、致畸、致突变的作用。这类物质可以对动物的内分泌调节作用产生重大影响，从而导致动物不能正常生长和发育。间苯二甲酸酯类物质主要通过食品生产加工和包装过程所接触材料迁移进入食品。间苯二甲酸酯也是高脂溶物质，主要污染鱼、肉、蛋及含油脂等食品。但目前我国对此类苯二甲酸酯的检测方法标准却是空白，甚至也很少有人研究包装材料中这类物质的检测方法。因此，我国目前缺少对这类污染物进行监管的技术条件。但随着间苯二甲酸二甲酯限量的制定，欧盟将会逐渐重视这类污染物的检测，这将对我国今后的食品和食品包装材料出口贸易产生重要的影响。此外，食品接触材料中的这类环境内分泌干扰物在与食品接触之后将迁移到食品中，造成食品污染，直接危害我国人民的身体健康。因此，必须尽快建立测定这类化合物的系列检测方法标准，确保食品安全和降低出口风险，消除技术壁垒[4]。本文使用环己烷-乙酸乙酯混合溶剂作为提取溶剂，采用凝胶渗透色谱净化技术，首次对塑料食品包装材料中间苯二甲酸二辛酯的含量进行了测定。试验结果表明该方法准确、简便、快速，结果令人满意，为食品包装材料的质量安全监管提供了技术手段。

1 材料与方法

试验材料

供试试剂。环己烷、乙酸乙酯（HPLC级，美国Fisher公司）；间苯二甲酸二辛酯（纯度均≥98%，Dr. Ehrenstorfer标准品公司，CAS：137-89-3）；其他试剂均为分析纯（上海国药集团）。

试验仪器。由美国Thermo Fisher Scientific公司生产提供的TSQ Quantum GC串联四极杆气质联用仪、Xcalibur数据采集处理系统；由德国LC-Tech公司生产提供的凝胶渗透色谱仪（GPC）；由昆山市超声仪器有限公司生产提供的KQ5200DE数控超声波清洗器。

试验方法

制备间苯二甲酸二辛酯标准溶液。称取间苯二甲酸二辛酯标准品（要求精确至 mg），再利用正己烷将其配制成 1 000 mg/L的储备液。用环己烷-乙酸乙酯（1：1，v/v）逐级稀释成10、50、100、200、500 μg/L的标准工作溶液[5]。

样品前处理。首先将食品塑料包装材料粉碎成细小颗粒，要求粉碎程度达到单个颗粒

GC-MS分析条件。使用Rtx-5 MS毛细管气相色谱柱 （30 m× mm× μm），载气为高纯氦气，不分流进样，气体流速为 mL/min。柱箱初始温度为初始柱温70 ℃，以40 ℃/min的速度升温，直至将温度升至280 ℃，保持6 min；进样器温度为280 ℃，检测器温度为280 ℃。EI离子源，230 ℃，70 ev；质量扫描方式：选择离子监测（SIM），监测离子为167、279、149和261；其相对丰度比为167∶279∶149∶261=100∶32∶26∶9；定量离子为167。标准谱图调谐。

建立间苯二甲酸二辛酯标准曲线。标准工作溶液经过GC-MS分析测定后，以间苯二甲酸二辛酯的标准溶液浓度为横坐标，定量离子的峰面积为纵坐标，作校准曲线线性回归方程，以试样的峰面积与标准曲线比较定量。最终确定间苯二甲酸二辛酯含量在10～500 μg/L范围内呈现良好线性关系，其线性方程为Y=4313 （r2= 8）。

凝胶渗透色谱条件。凝胶渗透色谱柱：320 mm×25 mm （内径）玻璃柱，Bio-beads（S-X3），200～400目，50 g；流动相：环己烷+乙酸乙酯（1∶1，v/v）；流速：5 mL/min；流出液收集时间：20～35 min。取上述提取液5 mL按照凝胶色谱条件净化，收集净化液直接用于GC-MS测定[6]。

2 结果与分析

萃取溶剂的选择

在试验过程，分别选择二氯甲烷、丙酮、乙酸乙酯、正己烷和环己烷+乙酸乙酯（1∶1，v/v）等5种溶剂，并比较它们的萃取效率，以提高食品塑料包装材料中间苯二甲酸二辛酯的萃取效率。结果表明，当间苯二甲酸二辛酯的浓度为 100 μg/kg时，二氯甲烷、丙酮、乙酸乙酯、正己烷和环己烷+乙酸乙酯（1∶1，v/v）等5种溶剂的加标回收率分别为92%、95%、95%、96%、97%，即5种溶剂的萃取效率相当。但使用二氯甲烷萃取聚氯乙烯塑料时，由于二氯甲烷的浓缩液为粘稠状，因此存在污染分析仪器的风险。为减少试验步骤，考虑到GPC使用的溶剂为环己烷+乙酸乙酯（1∶1，v/v），最终将萃取溶剂定为环己烷+乙酸乙酯。

定性分析

间苯二甲酸二辛酯标准物质的总离子流色谱图见图1，待测成分的保留时间为 min，而加标的样品中间苯二甲酸二辛酯与标准物质的保留时间相同，且峰形表现为尖锐对称，待测物的色谱峰周围很少看到干扰色谱峰。此外，间苯二甲酸二辛酯标样全扫描质谱图见图2，比较两者的全扫描质谱图可以发现，其离子碎片主要是167、279、149和261等，且相对丰度比基本上是100∶32∶26∶9。这说明该方法分离比较完全，且具有抗干扰能力强的优势，完全可以用于对间苯二甲酸二辛酯的准确定性分析[7]。

净化条件的优化

食品包装材料印刷油墨的成分较复杂，通常会含有较多有机杂质，存在较大的基质效应，需对样品的提取液进行净化处理。提取液的一般采用固相萃取小柱进行净化，但考虑到GPC是除油墨中大分子杂质的较理想的净化方法，且容易实现自动化[4]，因此试验净化处理方法采用GPC。同时，分别将收集时间设定为10～15、10～20、10～25、10～30 min，考察流出液收集时间对于目标化合物回收率的影响。试验结果表明，以10～25、10～30 min时间段的间苯二甲酸二辛酯的平均回收率较好，最终将GPC流出液的收集时间定为10～25 min，以利于节约溶剂。通过GPC净化和富集，样品基质的背景噪音得到降低，效果很好。

空白样品的加标回收率和精密度

向空白样品中添加间苯二甲酸二辛酯标准溶液，浓度分别为、、、、 mg/kg，然后利用上述方法进行检测分析，获得间苯二甲酸二辛酯的平均回收率分别为108%、81%、79%、93%和92%（表1）。试验结果表明，对于间苯二甲酸二辛酯定量测定的要求，该方法的回收率和精密度均可满足。根据对空白样品进行试验测定的检出限，确定方法的检出限为 mg/kg。

3 结论与讨论

试验结果表明，笔者建立的食品塑料包装材料中间苯二甲酸二辛酯残留检测的GC-MS方法具有简单、灵敏和快速的优点，而且笔者还优化了食品塑料包装材料的提取溶剂等前处理方法和GC-MS分析仪器条件[7]，最终说明该方法可应用于食品塑料包装材料中间苯二甲酸二辛酯的定性定量检测，填补了国内空白。

4 参考文献

[1] 陈志锋，潘健伟，储晓刚，等。塑料食品包装材料中有毒有害化学残留物及分析方法[J].食品与机械，2006，22（2）：3-7.

[2] 陈军，柳艳。残留的检测[J].检验检疫科学，2008，18（6）：45-47.

[3] 张伟亚，王成云，刘丽。固相微食品包装材料中邻苯二甲酸酯增塑剂萃取气相色谱-质谱法测定塑料浸泡液中己二酸酯类增塑剂的溶出量[J].塑料科技，2007，35（2）：74-76.

[4] 张居舟，李静，何俊，等。凝胶渗透色谱-气相色谱串联质谱法同时测定食品包装材料印刷油墨中8种光引发剂[J].中国印刷与包装研究，2014，6（6）：118-123.

[5] 张磊，吴青，梁健华，等。高效液相色谱法同时测定食品塑料包装材料中8种邻苯二甲酸酯的含量[J].食品科学，2012（20）：184-188.

凝胶色谱法【第二篇】

摘要：目的 研究吡喹酮水凝胶栓剂经直肠给药后在家兔体内的药动学及相对生物利用度。方法 取家兔12只，随机分为口服给药组和直肠给药组二组，给药后采用hplc法测定血药浓度。 结果 经3p97药动学程序处理吡喹酮水凝胶栓剂经直肠给药的药-时数据符合一房室开放药代动力学模型，其相对生物利用度为%。 结论 吡喹酮水凝胶栓剂的生物利用度是口服给药的倍，具有一定的开发价值。

关键词：吡喹酮水凝胶栓剂；高效液相色谱法；药动学；生物利用度

abstract: objective to study the pharmacokinetics and bioavailability of praziquantel liquid suppository in rabbits. method a single dose of praziquantel was orally and rectally administrated to 12 rabbits in an open randomized crossover test. hplc was selected to determine the concentration of praziquantel in plasma. result the pharmacokinetic parameters of praziquantel were obtained by3p97 program and best described by a onecompartment model. relative bioavailability of praziquantel was %. conclusion the praziquantel liquid suppository has higher bioavilability than praziquantel solution in rabbits.

key words:praziquantel liquid suppository; hplc; pharmacokinetics; bioavailability

吡喹酮（praziquantel,pzq）是人工合成的吡嗪异喹啉衍生物，为一种高效、广谱的抗血吸虫和抗绦虫药。目前临床应用的吡

喹酮制剂主要是片剂和胶囊，但口服用药首过效应大，生物利用度低，使用受到一定限制。温敏水凝胶是一种智能高分子材料，能随环境温度的变化发生可逆性的膨胀-收缩，高温收缩型水凝胶在温度低于低温临界溶解温度（lower critical solution temperature，lcst）时，凝胶在水中形成良好的水化状态，温度升高，凝胶脱水收缩［1-3］，利用此性质可以控制药物的释放。经查阅国内外有关文献，未见有吡喹酮水凝胶栓剂的报道，本文采用泊洛沙姆p407/p188［4-5］制备了吡喹酮水凝胶栓剂，并采用hplc法［6］检测其经直肠给药后家兔体内的血药浓度、药动学和生物利用度。

1 仪器、试药与实验动物

仪器与试药

美国agilent公司1100高效液相色谱仪，dad检测器，色谱柱zorbax sb-c18（ mm×250 mm,5 μm），bf?2000氮气吹干仪（上海八方世纪科技有限公司）。吡喹酮原料药（上海菱玉贸易有限公司，9917%，批号0410031）；吡喹酮标准品(中国药品生物制品检定所)；吡喹酮水凝胶栓剂（2%，本室研制）;地西泮对照品 (中国药品生物制品检定所提供)；泊洛沙姆（德国，basf公司提供）；乙腈、甲醇均为色谱纯；其他试剂均为分析纯。

实验动物

大白兔（由武汉大学医学院实验动物中心提供），体质量（±） kg,雌雄各半。

2 实验方法及结果

色谱条件

色谱柱zorbaxsb c18柱( mm×250 mm,5 μm) ，agilent色谱工作站，dad检测器； 流动相： 乙腈水（体积比70∶30）;内标： 地西泮；检测波长：220 nm;灵敏度：;流速： ml・min-1;纸速： cm・min-1。

标准溶液的制备

精密称取干燥至恒重的吡喹酮 mg于100 ml量瓶中，加流动相溶解后用流动相稀释配成5 μg・ml-1的标准液。精密称取干燥至恒重的地西泮 mg于100 ml量瓶中，加流动相溶解后用流动相稀释配成 μg・ml-1的内标液。

血浆的处理

取空白血浆2份，各 ml，置于10 ml具塞离心管中，其中1份加入适量吡喹酮标准液和20 μl内标液；各加入醋酸乙酯3 ml提取，振荡2 min，以3 000 r/min离心，取有机层经氮气吹干，残留物用100 μl流动相溶解，取20 μl进样。药物及内标物的保留时间分别为和 min,见图1。

标准曲线的制备

取空白血浆 ml，分别置于6只10 ml具塞离心管中，加入不同量吡喹酮标准液和内标液20 μl，配成每1 ml含吡喹酮、、、1、2、5、10 μg的溶液，按“”项下，以吡喹酮与内标峰面积比值(a)对吡喹酮质量浓度(ρ)作线性回归，得标准曲线方程：a=- 7+ 4ρ(r= 3),最低检测浓度（s/n≥3）为 μg・ml-1。

回收率测定

取空白血浆精密加入已知量的吡喹酮，然后按“23”项下操作，测得吡喹酮与内标峰面积比值，代入标准曲线求出各样品的浓度，将求得的浓度与已知加入的浓度相比，计算相对回收率，结果见表1。表1 回收率试验结果（略）

精密度测定

取空白血浆，精密加入低、中、高3种浓度的吡喹酮，按“”项下操作，进行日内和日间精密度考察，日内各浓度测定5次，连续测定5天，计算日内、日间精密度结果见表2。表2 精密度试验结果（略）

血药浓度的测定

取雌、雄各半的健康家兔12只，禁食24 h,分为2组，每组6只。口服给药组以配制的2%ρ吡喹酮cmc-na混悬液灌胃给药。直肠给药组以吡喹酮水凝胶栓剂经直肠给药，封闭以免溢出。两组给药剂量均为40 mg/kg。给药后，于、、1、2、3、4、6、8、10 h自耳缘静脉采血2 ml。血液用肝素抗凝，离心10 min(3500 r/min)分离血浆。然后按“”项下操作制备血样，进样20 μl进行含量测定，药时曲线见图2。

药动学分析

利用3p97药代统计数据包对药时曲线进行不同的代谢模型拟合，直肠给药和口服给药均与一房室模型较为接近。分别对两组家兔的药代动力学参数进行计算，结果见表3。表3 药物动力学参数（略）

3 讨 论

将吡喹酮作为治疗药物，以高温收缩型水凝胶为载体，制备得吡喹酮水凝胶栓剂。其具有以下优点：在体外呈凝胶，在体温下很快胶凝；易于从给药而无异物感，从而提高患者用药顺应性；对直肠有生物黏附性，给药约数分钟后即凝固成固体，不易遗漏；无首过效应，可大大提高其生物利用度；同时可减少对胃肠道刺激，降低不良反应的发生率。

从表3可知，直肠给药组的吸收速率常数ka为 h-1，其最高血药浓度cmax为 μg・ml-1，达峰时间tmax为 h；口服给药组吸收速率常数ka为 h-1，其最高血药浓度cmax为 μg・ml-1，达峰时间tmax为 h。这表明吡喹酮水凝胶栓剂的吸收优于吡喹酮溶液；由于吡喹酮水凝胶栓剂处方中加入生物黏附剂，当直肠给药时栓剂不向前滑动，药物不会经直肠上端静脉吸收入肝门静脉而被破坏，而经直肠下端静脉充分吸收后直接进入大循环，减少了药物的首过作用而提高了生物利用度［7］，其相对生物利用度为%，是口服给药组的倍。

参考文献：

［1］miyazaki s,nakamura t,takada solgel transition of pluronic f127［j］.yakuzaigaku,1991,51:36.

［2］王昌华，曹维孝。温敏水凝胶［j］.化学通报，1996(1)：33.

［3］王明坤，方晓玲。泊洛沙姆在药剂学中的应用［j］.中国医药工业杂志，2002，33（12）：621.

［4］choi h g,jong j h,ryu j m,et of in situgelling and mucoadhensive acetaminophen liquid suppository［j］.int j pharm,1998,165:33.

［5］mi ok yun,han gon choi,jae hee jung,et of a thermoreversible insulin liquid suppository with bioavailability enhancement［j］.international journal of pharmaceutics,1999,189 ：137.

凝胶色谱法【第三篇】

关键字 蛋白质组；蛋白质组学；研究技术；分离技术

中图分类号 Q-0 文献标识码A 文章编号 1674-6708（2013）107-0135-02

0 引言

近几年基因组学的不断发展与壮大，推动了生物学技术的快速发展，使得我国在生物技术方面的研究走向成熟，大部分的病毒和原核生物等简单生物的基因组工作已经完成，而且高等生物的基因组工作也取得了很大的进步，人类的基因组研究已经顺利完成。随着科技的不断发展，在生物学界产生了许多新的技术，新的基因组研究手段与方法，可以实现对数以万计的基因表达进行检测。但是，这仅仅在生物功能的静态分析上取得了很大的进步，却依然不能达到对基因组学研究的目的。正因如此，越来越多的专家将研究矛头指向了蛋白质组的研究。只有研究基因编码和翻译的蛋白质，才能真正的了解到生物的活动特征。

1 蛋白质组概念和蛋白质组学研究的范围

在20世纪90年代根据蛋白质和基因组的技术提出了蛋白质组的概念，蛋白质组指的是一组基因或者细胞所有的蛋白质表达的情况，与基因组类似，但是与基因组不同的是，蛋白质组更注重于对研究体代谢的一系列动态过程进行研究。从蛋白质组的名称上可以了解到，蛋白质组不是针对于单一的蛋白质进行研究，而是把一组蛋白质的整体作为研究对象，最后分析出每个蛋白质的表达信息。蛋白质组学是由于蛋白质组的出现而兴起的一门生物技术学科，蛋白质组学，即一个基因组，一个细胞或组织，一种生物在一定时间，一定条件下所表达的全部蛋白组成，存在形式，活动方式及时空动态。目前蛋白质组学主要研究生理、病理或不同发育阶段下蛋白质的表达情况，对表达存在差异的蛋白质进行进一步研究，分析蛋白质之间的相互作用，蛋白质的组成结构，以及蛋白质的翻译和定位情况等。

2 蛋白质组研究的主流技术

蛋白质组研究的进展与蛋白质组研究技术的发展是不可分开的，二者之间起到相互促进的作用。随着科学的进步，对于使用生物技术进行研究的结果要求越来越高，对数据要求也越来越精确，所以蛋白质组研究的技术也在不断创新与更新，目前针对于蛋白质的分离来说，蛋白质组研究的主流技术包括双向凝胶电泳技术、差异凝胶电泳技术、质谱技术以及多维液相色谱技术等。

双向凝胶电泳技术

传统的双向凝胶电泳技术由1975年建立，采用双向凝胶电泳技术进行蛋白质组分离大大的提高了分辨率，因此，在蛋白质组研究技术中一直被广泛采用。其产生双向的原理是：第一向为等电聚焦，使得带有不同电荷量的蛋白质产生电泳分离，第二向为SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，使得具有不同分子量的蛋白质产生电泳分离。

随着技术的提高，双向凝胶电泳技术也进行了完善，目前所使用的双向凝胶电泳技术中第一向利用固相pH梯度等电聚焦电泳技术来达到蛋白质组分离的效果，这样可以在保证在高分辨率的前提下，提高重复性，而且可以获得蛋白质具有的分子量多少以及其等电点信息，但是，这种方法难以实现对于极大蛋白质、极小蛋白质、极碱性蛋白质和疏水性蛋白质进行有效分离分析与研究。

差异凝胶电泳技术

差异凝胶电泳技术是在双向凝胶电泳技术上发展起来的，差异凝胶电泳技术在一定程度上弥补了双向凝胶电泳技术的不足，不但提高了蛋白质组的分离效率，而且降低了劳动强度，最重要的是提高了电泳的灵敏程度。差异凝胶电泳技术的原理是对两份不同的蛋白质组研究样品做不同的标记，然后放在同一环境下进行凝胶电泳，可以直观的观察到正常的基因组和癌变的基因组的凝胶电泳结果的区别，继而可以对两种不同的蛋白质表达结果进行进一步分析与研究。

质谱技术

采用质谱技术对蛋白质组进行分离的原理是：首先将蛋白质组研究样品的分子进行离子化，然后根据不同离子的质荷比不同来确定其分子量，最后实现对其进行分离。在进行蛋白质组样品分子进行离子化的时候，需要保证分子的完整性，尽量不要形成碎片离子。质谱技术通过与其他高端技术的配合，可以实现对多肽的序列进行测量。

多维液相色谱技术

多维液相色谱技术是蛋白质组研究过程中最常用的色谱分离技术之一，主要是通过多种色谱分离技术的联合使用来达到多维的效果，由于科学技术的更新速度比较快，而且生物技术研究的数据量越来越多，蛋白质组研究的样品复杂程度越来越高，所以实现蛋白质组自动化分离成为必然趋势，目前，蛋白质组自动化分离系统已经形成，就是将多维液相色谱技术与串联质谱技术联合使用便可以达到快速、高效、精确的蛋白质组自动化分离。但是，这种蛋白质组分离技术依然存在一定的不足，譬如，不能实现将分子量过小的蛋白质进行分离以及不能对蛋白质的差异表达进行分析等。

3 蛋白质组生物信息学

近几年来，蛋白质组研究技术已经得到了生物信息学的高度重视，甚至大部分国家政府已经大力支持蛋白质组的研究，蛋白质组的研究为生物学和医学做出了很大的贡献，蛋白质组研究技术的发展推动了我国生物学与医学的快速发展，同时生物信息学的发展也为蛋白质组的研究工作提供有力的保证，生物信息学是在生命科学、计算机技术与严密、精确的数学科学计算上发展的交叉型学科，通过对生命科学样本的研究，以及运用数学分析与计算，利用计算机技术手段实现将得到的数据和结论信息进行收集、加工和存储。

4 结论

由于生物学科学技术的提高，蛋白质组学得到了广泛的重视，同时也受到了许多政府的大力支持，成为了基因组计划研究的核心，蛋白质领域的建立为生物学家进行蛋白质结构的研究提供了新的角度与新的研究理念。蛋白质组技术的发展，对一些细菌蛋白质的研究和对分析疾病的产生原因与治疗起着深远的影响与重要的意义。

参考文献

[1]成海平，钱小红。蛋白质组研究的技术体系及其进展[J].生物化学与生物物理进展，2000（27）：584-588.

[2]解建勋，蒲小平，李玉珍，李长龄。蛋白质组分析技术进展[J].生物物理学报，2001（1）：119-126.

凝胶色谱法【第四篇】

关键词　盐溶蛋白电泳法；玉米种子；纯度鉴定；常见问题；处理方法

中图分类号 ；S513 文献标识码 B 文章编号 1007-5739（2012）17-0069-01

盐溶蛋白电泳法鉴定玉米种子纯度是基于品种间种子贮藏蛋白中盐溶蛋白质的组分差异来鉴定玉米种子纯度[1]。从玉米种子中提取出的盐溶蛋白在聚丙烯酰胺凝胶电泳的浓缩效应、分子筛效应、电荷效应作用下得到分离，通过染色显示系列蛋白质谱带根据谱带差异情况鉴定玉米种子的真实性和品种纯度。该方法快速准确、经济实用，于2001年被列为行业标准。该标准是我国第一部利用种子贮藏蛋白电泳技术鉴定玉米种子纯度的行业标准。标准的实施为我国玉米种子室内纯度鉴定提供了重要的手段，在玉米种子纯度检验工作中得到了广泛的应用。笔者结合工作实践总结在实际使用该标准中可能遇见的问题及处理建议，以供同行们商榷。

1 凝胶液不凝或者聚合缓慢不能形成胶体

如果在胶液中加入催化剂过氧化氢后，凝胶液不凝或聚合缓慢不能形成胶体，可能由以下几个原因造成：一是药品纯度不够；二是试剂配比不当；三是胶液过期；四是催化剂失效。在实际操作中，常常会碰到分离胶能够聚合，而浓缩胶不能聚合成胶体的情况，这是因为浓缩胶对试剂纯度的要求比分离胶液更高，若出现该种情况，首先，要特别注意N，N-亚甲基甲叉双丙烯酰胺的纯度和保质期，要求其纯度最好是%以上的分析纯；其次，由于抗坏血酸不稳定，极易分解，因此在胶液中可适当增大抗坏血酸的比例至标准中的倍或倍。可促进胶液聚合，并可有效延长胶液的保存期30～40 d。

2 点样孔破裂较多

从浓缩胶中拔出样品梳时，点样孔破裂较多，会使试验终止。这是应用电泳法检测种子纯度最常发生的情况，可能有以下几种原因，一是样品梳齿厚度不合适；二是催化剂过氧化氢的用量不合适；三是凝胶聚合的时间不够；四是拔梳子时用力不均，方式不对。通常在进行该步操作时，首先，要仔细检查样品梳齿的厚度与两玻璃板狭槽是否合适，不能过紧，要稍微有一点空隙为宜，否则凝胶聚合后，很难拔出。其次，催化剂的用量要合适，量少聚合时间长，量多聚合太快，最好先进行预试验，确定催化剂的用量及聚合时间再倒胶，按经验，通常5 mL的浓缩胶液加入5～6 μL的3%过氧化氢，聚合4～5 min，再拔出梳子较适宜。再次，拔梳子时，把短玻璃面朝向自己，双手平放在梳子的近两端处，两手均匀用力，先前后稍微平晃一下梳子，再把手放在梳子中部，前后稍微平晃一下梳子，造成梳子整体松动，然后两手先放在梳子近两端处向左右稍拉紧梳子同时再缓慢向上抬起梳子，注意如果两端梳子齿已抬起而中部梳子齿未抬起时，不能再向上抬，可把两手平放在近中部，稍倾斜往自己怀里方向缓抬，使中部梳子齿抬起，最后再把手放在梳子近两端处缓慢向上抬起，同时稍往自己怀里方向晃动，一次性拔出梳子，即可获得较满意的点样孔。

3 凝胶粘板

电泳后，从2块玻璃板中取出凝胶时，常会出现凝胶粘板不好剥离的情况。产生的原因通常：一是玻璃板清洗的不干净或有划痕。因此，在清洗玻璃板时，一定要仔细，先用软毛刷小心刷洗玻璃板两面，并在蒸馏水中浸泡然后放在玻璃架上自然晾干或烘干。二是取凝胶时温度较高。一般电泳完成后，玻璃板还很热，如果马上卸板取出凝胶就容易出现凝胶粘板不好剥离的情况。通常从胶条上取出玻璃板后稍放置一段时间，让凝胶冷却或用冷水冲玻璃板两面散发凝胶热量再卸板。也可把取下的玻璃板直接放在冷水中，通过热胀冷缩效应使玻璃板与凝胶分离再进行卸胶。

4 蛋白质谱带问题

蛋白质谱带较少或样品间普带宽窄及着色深浅不一

凝胶染色后，有的样品蛋白质谱带较少或样品间谱带宽窄及着色深浅差别较大，产生原因可能是样品制作上不规范造成[2]。一是注意样品的磨碎程度要均匀一致，颗粒不宜过粗或过细。二是粉碎的样品装入离心管时，种子胚不能丢失，因为种子胚内有大部分盐溶蛋白，胚丢失会造成蛋白谱带严重缺少。三是离心管内所装的种子颗粒以半管为宜，不宜过多，否则提取液过少，造成某些蛋白未能提取出，致使某些蛋白谱带丢失。四是样品加入提取液后在室温放置时要充分摇匀，同时注意提前时间不宜过长，以防部分蛋白质降解，造成蛋白谱带缺失，一般放置30～40 min即可进行点样。

谱带弯曲

如果染色后，有些部位蛋白谱带弯曲，可能是分离胶中加入过氧化氢时，过氧化氢分布不均匀，使得凝胶聚合不均，造成蛋白谱带弯曲[3]。在倒分离胶时，加入过氧化氢后要充分摇匀保证胶液均匀一致并注意不要有气泡再倒胶。还有可能是电泳时，电极缓冲液温度过高或凝胶液及电极缓冲液pH值不准确，改变了电泳系统的电阻，一般会使分子量小的蛋白谱带弯曲，可以通过接入冷却水的方法降低电极缓冲液的温度，另外在倒胶和加入电极缓冲液时测一下pH值，并用乳酸调整到准确时再进行电泳。

蛋白谱带模糊不清

凝胶染色后，发现蛋白谱带模糊不清，可能由以下原因产生：一是凝胶液或样品提取液存放时间过长，使得某些不稳定试剂挥发或失效，造成凝胶染色后蛋白谱带模糊不清，可考虑重新配制试剂并缩短使用期[4]。二是染色液使用次数较多，使得各成分比例不当，染色后会导致蛋白谱带模糊不清。染色液用过1次后，三氯乙酸会有挥发以及考马斯亮蓝会结合在凝胶中的蛋白上，因此下次再使用时要适当添加三氯乙酸和染色液。一般每200 mL染色液，下次再使用时可适当添加5～7 mL的染色原液和50 mL的三氯乙酸。三是电泳时电极缓冲液温度过高或pH值不准确，导致电泳速度过快。染色后蛋白谱带变宽，模糊不清，甚至弯曲。电泳前要准确调整电极缓冲液pH值，并通过连接冷却水来降低电极缓冲液的温度。四是样品提取时，放置时间过短或过长。染色后也会造成蛋白谱带模糊不清。样品提取时放置时间过短，蛋白没有提取出或含量较少；放置时间过长，提取的蛋白会部分降解，此2种情况均会导致染色后蛋白谱带模糊不清或谱带缺失。一般提取时间在30～50 min较适宜。染色后蛋白谱带清晰，分辨率高。

5 参考文献

[1] 王玺，张宝石。玉米种子纯度鉴定技术研究进展[J].种子，2002（1）：43-45.

[2] 闫米格，许晶，骈跃斌，等。玉米种子纯度鉴定中DNA提取方法的比较研究[J].山东农业科学，2011（9）：7-8，14.